高效液相色谱法测定肥料中3，4-二甲基吡唑磷酸盐的方法研究

保万魁，黄均明，韩岩松，刘 蜜，刘红芳

（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）

通过在氮肥或其施用过程中添加硝化抑制剂和脲酶抑制剂（统称为肥料增效剂［1-2］）来降低土壤脲酶、土壤亚硝酸细菌活性，从而减少氮损失，是提高氮肥利用率的重要途径之一。

3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）是国内外研究较多的一种新型硝化抑制剂。DMPP 分子式为C5H8N·H3PO4，灰白色粉状物质，分子量为194.2，熔点165℃，密度1.51 g/cm3（20℃），水中溶解度为132 g/L，pH 值为2.5～3.0，蒸汽压小于10-4Pa（20℃）［2］。作为硝化抑制剂，其可以和铵态氮肥及能产生铵态氮的酰胺态氮肥尿素等混合使用。许多试验表明，DMPP 在提高作物产量、改善品质、提高作物氮肥利用率、减少环境污染方面的作用效果显著［3-12］。同时，与其它硝化抑制剂相比，DMPP 还具有用量小、抑制效果好、对土壤和作物均没有毒害的优点，并且在土壤中降解慢，抑制时间较长，迁移性小，不易与土壤剖面中的铵态氮分离［13-14］。因具有上述诸多独特效果，DMPP 在农业上的应用也日益广泛［3］。目前已在中国、澳大利亚、比利时、法国、德国、意大利、西班牙和新西兰等多个国家注册［2，4，15-16］。

然而，DMPP的作用效果在不同环境条件下存在一定的波动性。其硝化抑制效率的高低、有效作用期的长短及施用效果，均受到用量和施用形式、土壤质地、环境温度、土壤水分、土壤酶活性、土壤酸碱状况等多因素的综合影响［10，17］。因此，有研究者认为DMPP 硝化抑制效果不如氯甲基吡啶［18］，或DMPP 对农产品没有明显的增产效果［8］。虽然施用DMPP 显著减少了温室气体N2O 和CO2的排放量，但是增加了氨的挥发［13］。

可以看出，作为硝化抑制剂的DMPP 必须科学、适量使用才能达到预期效果和最佳效益。而准确定量测定是做好此类产品生产、管理和施用的关键。近年来，DMPP 在我国的应用越来越多，但国内关于DMPP 测定方法的研究很少，有个别涉及气相色谱法测定土壤和缓释尿素中DMPP 含量的报道，采用内标法，操作相对繁琐［19-20］，而国内关于液相色谱法测定肥料中DMPP 含量的研究未见报道。因此，研究建立肥料中DMPP 含量测定的方法显得十分必要，研究结果将为此类产品生产控制、质量监督、市场监管，尤其是科学施用等工作提供检测手段，并在一定程度上为推动肥料产业健康发展提供技术参考。欧盟于2012 年出台了相关标准“Fertilizers-Determination of 3，4-dimethyl-1H-pyrazole phosphate（DMPP）-Method using high-performance liquid chromatography（HPLC）”（EN 16328：2012），该方法适用于矿质氮肥，且固定的称样量（30 g）和较窄的标准曲线范围等具体操作决定了其主要针对目标物含量相对单一的样品测定。但根据肥料增效剂和增效氮肥在我国的发展和应用实际，需要面对的样品不仅仅是矿质氮肥，还包括纯DMPP 硝化抑制剂产品、添加DMPP的有机无机复混肥料、有机肥料以及多种原料混合的肥料样品等，因此，本文在参考上述欧盟方法仪器条件的基础上，重点就目标物提取、方法线性和稳定性，以及不同原料的可能影响等方面进行研究，力求建立适用于目标物含量变化范围宽、样品种类和基体复杂多样等具体实际的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

除另有说明外，本方法中所用试剂为色谱纯，水符合GB/T 6682 中一级水要求。

乙腈；

一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O），分析纯；

3，4-二甲基吡唑磷酸盐标准品，纯度≥99.5%，在-20℃条件下贮存；

3，4-二甲基吡唑磷酸盐标准溶液：ρ（DMPP）=1000 mg/L。准确称取0.1 g（精确至0.0001 g）3，4-二甲基吡唑磷酸盐标准品，置于100 mL 容量瓶中，加入50 mL 水并振荡至完全溶解后，用水定容。

1.2 仪器和设备

Waters2695 高效液相色谱仪，配紫外检测器；AS 系列超声波清洗器；JRA-604C 恒温振荡器；BSA224S 型电子天平（精度0.0001 g）；微孔滤膜：0.45 μm，水系。

1.3 供试样品

样品包括搜集的肥料和DMPP 产品，以及自制的样品共若干个。

1.4 分析步骤

1.4.1 试样的制备

固体样品缩分至约100 g，将其迅速研磨至全部通过0.50 mm 筛（如样品潮湿，可通过1.00 mm筛），混合均匀，置于洁净、干燥的容器中；液体样品经摇动均匀后，迅速取出约100 mL，置于洁净、干燥的容器中。

1.4.2 试样溶液的制备

称取0.1～3 g（精确至0.0001 g）混合均匀的试样于250 mL 容量瓶中，加约200 mL 水，塞紧瓶塞，摇动容量瓶使试料分散，置于常温振荡器内，在180 r/min 频率下振荡后用水定容并摇匀，过微孔滤膜后待测。

1.4.3 仪器条件

——色谱柱：C18，5 μm，150 mm×4.6 mm（长×直径），或相当者；

——流动相：将1.38 g 一水合磷酸二氢钠溶于1 L 水中，加入175 mL 乙腈，脱气；

——流速：1.5 mL/min；

——柱温：室温；

——进样量：10 μL；

——检测波长：224 nm。

1.4.4 标准曲线的绘制

分别吸取DMPP 标准溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mL 于6 个10 mL 容量瓶中，用水定容，摇匀。该标准系列溶液质量浓度分别为0、20、50、100、200、300 mg/L。过微孔滤膜后，按浓度由低到高进样检测，以标准系列溶液质量浓度（mg/L）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4.5 试样溶液的测定

将试样溶液或经稀释一定倍数后，在与测定标准系列溶液相同的条件下测定，在标准曲线上查出相应的质量浓度（mg/L）。

2 结果与分析

2.1 不同提取条件对测定结果的影响

在其他分析条件保持一致的条件下，参考相关方法的提取条件［21］，在常温下分别选择超声和180 r/min 频率下振荡两种方式，用不同时间处理样品，其中D1 由复混肥料样品添加DMPP 制得，D2 由有机无机复混肥料样品添加DMPP 制得。所测结果见表1。

表1 不同提取条件对DMPP 测定结果的影响

结果表明，所选两个样品在振荡15 min 条件下测定结果略低，而在其他提取方式、时间的比较之间没有明显差别。但因样品均匀性和代表性需要，实验人员往往选择适当增大称样量的做法，为保证这种情况下试样的提取完全，以及从通常实验室设备条件和实验提取效率考虑，确定选择常温振荡30 min的前处理条件。以下实验均按此条件进行样品前处理。

2.2 线性范围、回归方程、检出限和精密度

在实验确定的分析条件下，对一系列浓度的3，4-二甲基吡唑磷酸盐标准溶液进行测定。结果表明，3，4-二甲基吡唑磷酸盐在0.1～1000 mg/L 范围内具有良好的线性关系。以3，4-二甲基吡唑磷酸盐质量浓度x（mg/L）为横坐标，峰面积y 为纵坐标（图1），得出回归方程y=7.21×103x+8.08×103（R2=0.9999）。对空白进行11 次测定，得到标准偏差，以3 倍标准偏差除以标准曲线斜率，求得检出限，结果为0.004 mg/L。

随机选取一份样品，称取7 份试样进行平行测定，用以考察实验方法精密度。7 次平行测定平均值为76.87%，相对标准偏差为0.28%。

2.3 稳定性

用确定的实验方法，随机选取不同DMPP 含量的数个样品，前后间隔30 d 分别进行两次DMPP含量测定，考察方法稳定性，结果见表2。测定值1 和测定值2 分别为不同时间两次平行测定结果的算数平均值。结果显示，用该方法对间隔34 d的样品重新测定，结果一致性很好，这说明该方法稳定性良好。

表2 DMPP 测定方法稳定性实验结果 （%）

2.4 不同氮肥原料对测定结果的影响

为验证与3，4-二甲基吡唑磷酸盐可配合使用的氮肥原料对其测定结果是否有影响，选择氯化铵、硝酸铵、硝酸钾、尿素、尿素硝酸铵溶液以及复混肥料等样品，用加标法测定回收率，结果见表3。

从表3 看出，供试样品中DMPP 回收率两次平行测定结果一致性很好，且两次测定平均值均在97.9%～101.4%范围内。另外，实验过程中通过观察发现DMPP 色谱图峰形均很好（图2，图3），这说明与DMPP 可配合使用的氯化铵、硝酸铵、硝酸钾、尿素等氮肥原料及其不同组合（如尿素硝酸铵溶液和复混肥料），以及部分有机物料和NBPT、NPPT 等均不会干扰DMPP的定量测定。更进一步说明，不同氮形态以及氮、磷、钾的混合均不对DMPP 测定造成干扰。

表3 不同原料对3，4-二甲基吡唑磷酸盐测定结果的影响 （%）

3 结论

通过样品前处理条件、方法线性、准确性、稳定性等实验研究，建立了一种外标法测定DMPP含量的高效液相色谱仪方法。结果显示这种方法的精密度、准确性等方法性能指标均能满足检验的要求。方法在0.1～1000 mg/L 范围内线性良好（R2=0.9999），回收率均在97.9%～101.4%之间。同时，该方法具有前处理简单、分析速度快、干扰因素少、方法稳定且结果准确等特点，适合DMPP产品及不同肥料中DMPP 含量的批量测定。此方法的建立将为我国此类产品生产、流通和使用等环节的管理实践提供参考技术手段，也将在一定程度上为推动肥料产业健康发展提供基础支撑。