肺鳞癌中E2F1、E2F6及TPX2的表达及临床意义

庞一雄 李萍 胡磊 胡琦 项安华 朱泉

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(non-small cell Lung carcinomas，NSCLC)占肺癌的80%，是肺癌的主要类型[1]。肺鳞癌是NSCLC主要病理亚型[1]，虽然生活条件和医疗水平有明显改善，特别是手术切除，放疗和化疗等传统治疗有明显进展，但是NSCLC患者早期临床表现不典型，大部分到中、晚期才确诊，而中晚期患者手术治疗效果往往欠佳，所以5年生存率总体偏低[2-3]。除了传统的治疗方法外，肺癌分子靶向治疗为我们提供了新的研究方向，寻找靶向治疗肺鳞癌的特异性生物标志物是目前研究难点。E2F1、E2F6均为E2F转录因子家族的一员，在多种肿瘤疾病中均有报道，但国内有关E2F6的报道相对不多[4-5]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)是在细胞进行有丝分裂时纺锤体形成过程中发挥作用的一种微管相关蛋白，与小细胞肺癌发生有关[6]。目前，E2F1、E2F6、TPX2在肺鳞癌中的表达情况及与临床病理关系较少有人研究。因此，本研究将通过检测E2F1、E2F6、TPX2在肺鳞癌组织及癌旁组织中的表达情况，以期为进一步研究肺鳞癌治疗、预后提供有价值的线索。

资料与方法

一、研究对象

选取2019年2月至2020年10月于本院收治进行手术的肺鳞癌患者58例。取肺鳞癌患者手术中新鲜离体的肺鳞癌组织100 mg作为研究样本，取癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5 cm，且术后病理证实无癌细胞)50～100 mg作为对照样本，手术样本离体后均经液氮速冻，-80 ℃冰箱保存用于后续实验。其中男39例，女19例，平均年龄53.89±7.85岁。TNM临床分期标准以国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)第8版为准，分为Ⅰ期11例、Ⅱ期14例、Ⅲ期20例、Ⅳ期13例。收集肺鳞癌患者一般资料，包括：年龄、性别、肿瘤直径、淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度和吸烟史。

纳入标准：(1)病理确诊为肺鳞癌。(2)通过本院伦理委员会审核，符合相关伦理学规定。(3)所有研究对象及其家属知情，并签署知情同意书。

排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤、严重肝肾功能障碍、全身性感染、免疫系统疾病、精神疾病、严重代谢性疾病者。(2)术前接受过局部放疗、全身化疗、生物免疫治疗、其他辅助治疗或其他抗肿瘤治疗者。(3)妊娠哺乳期女性。(4)资料不完整或不真实者。

二 、主要试剂

TRIzol试剂(货号：GMS12279)购自深圳子科生物科技有限公司；逆转录试剂盒(货号：AB-4366596)购自上海嵘崴达实业有限公司；荧光定量PCR检测试剂盒(货号：KL190)购自上海康朗生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪(型号：Prism®7500)购自美国应用生物系统公司；E2F1、E2F6、TPX2及GAPDH引物均由华大基因科技有限公司设计并合成，引物序列(见表1)。

表1 引物序列

三、 qRT-PCR法检测肺鳞癌及癌旁正常组织中E2F1、E2F6和TPX2表达水平

1 RNA提取

使用TRIzol试剂提取总RNA。每份样本取50～100 mg于匀浆器中，加液氮研磨成粉末状，加入1 mL TRIzol试剂处理，转移匀浆至无RNAase的Eppendof管中，4 ℃离心20 min后取上清，之后步骤均严格按照TRIzol试剂说明书进行操作。使用紫外分光光度计测定260、280 nm波长处的RNA样本浓度及吸光度(A)值，当1.8

2 cDNA合成

将总RNA样品逆转录成cDNA。20 μL体系：0.2 μg/μL RNA 2 μL，通用引物1 μL，5×buffer 4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL和逆转录酶1 μL，DEPC水补至20 μL，充分混匀，42 ℃水浴1 h，70 ℃水浴5 min，灭活反转录酶。检验合成的cDNA质量，合格后-80 ℃保存备用。

3 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

采用qRT-PCR法检测肺鳞癌及癌旁正常组织中E2F1、E2F6和TPX2表达水平。内参基因为GAPDH基因。10 μL反应体系：SYBR Green Mix 5 μL，50 ng/μL cDNA 1 μL，10 μM上游引物0.5 μL，10 μM下游引物0.5 μL和ddH2O 3.0 μL。反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min；40个循环终止。qRT-PCR仪检测E2F1、E2F6和TPX2的相对表达值，每个标本测3次，计算平均值，Ct值为扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数，E2F1、E2F6和TPX2的相对表达值以2-ΔΔCt法表示。将E2F1、E2F6和TPX2的相对表达值由低到高排序，取中位数为界点，高于中位值为高表达，低于中位值为低表达。

四 、统计学分析

结 果

一 、E2F1、E2F6和TPX2在肺鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达

与癌旁正常组织相比，肺鳞癌组织中E2F1、E2F6和TPX2表达水平均明显上升(P<0.05)(见表2)。

表2 E2F1、E2F6和TPX2在肺鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达比较

二、 E2F1表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系

58例肺鳞癌患者癌组织中E2F1表达情况分别为低表达27例，高表达31例。肺鳞癌组织中E2F1表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、吸烟史无关(P>0.05)，与淋巴转移、肿瘤分化程度有关(P<0.05)(见表3)。

表3 E2F1表达与肺鳞癌临床病理特征的关系(n)

三、 E2F6表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系

58例肺鳞癌患者癌组织中E2F6表达情况分别为低表达25例，高表达33例。肺鳞癌组织中E2F6表达与患者年龄、性别、吸烟史无关(P>0.05)，与肿瘤直径、淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关(P<0.05)(见表4)。

表4 E2F6表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系(n)

四、TPX2表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系

58例肺鳞癌患者癌组织中TPX2表达情况分别为低表达21例，高表达37例。肺鳞癌组织中TPX2表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、吸烟史无关(P>0.05)，与淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关(P<0.05)(见表5)。

表5 TPX2表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系(n)

五、肺鳞癌组织中E2F1、E2F6和TPX2表达的相关性

相关性分析结果显示，肺鳞癌组织中E2F1和E2F6表达呈明显正相关(r=0.455，P<0.05)，TPX2和E2F1表达呈明显正相关(r=0.471，P<0.05)，TPX2和E2F6表达呈明显正相关(r=0.508，P<0.05)(见图1、2、3)。

图2 肺鳞癌组织中TPX2和E2F1表达的相关性分析

讨 论

肺癌是临床上危害人类健康最常见的呼吸系统恶性肿瘤之一。 中国国家癌症中心登记数据分析结果显示，2015年新发肺癌人数约为78.7万例，发病率高达57.26/10万，每年因肺癌死亡人数约为63.1万例，死亡率为45.87/10万。 肺癌导致恶性肿瘤疾病负担日趋严重，成为我国恶性肿瘤死亡主要病因[7]。肺鳞癌是肺癌中常见的病理类型，与肺腺癌相比，其发病机制的研究和治疗进展滞后[1,8]。由于特异性靶向治疗肺鳞癌的药物相对缺乏，患者预后结果差，5年生存率低于15%，即使进行了肺切除术，复发率、转移率仍处于较高水平[9]。虽然肺鳞癌早期临床表现不典型，但临床表现通常与肿瘤发生位置、病理类型、病情程度密切相关，所以，寻找与肺鳞癌临床病理有关、可能对治疗肺鳞癌有效的潜在靶基因，具有重要的临床价值。

图3 肺鳞癌组织中TPX2和E2F6表达的相关性分析

E2F1、E2F6均为E2F家族的重要成员，据报道，E2F家族是重要的转录因子家族，在细胞周期进展、DNA复制、DNA修复、细胞分化、增殖与凋亡等细胞过程中起调控作用[10-11]。Sun等[12]分析E2F1在肺癌患者中表达发现，肺鳞癌、肺腺癌组织中E2F1 mRNA和蛋白水平均高于正常肺组织。Wang等[13]分析发现，E2F1可以通过调控促进小细胞肺癌的上皮间质转化过程，参与小细胞肺癌的侵袭、转移。曹燕飞等[14]研究发现，E2F6参与肺鳞癌细胞的增殖与侵袭，通过上调miR-185，可靶向抑制E2F6蛋白表达，肺鳞癌细胞的增殖、侵袭能力亦随之受抑制。Zheng等[15]研究结果表明，E2F6在子宫内膜癌组织中表达上调，在低分化组织中表达高于高分化组织，在高迁移能力细胞系中表达高于低迁移能力细胞系，miR-424可通过抑制E2F6表达参与子宫内膜癌中细胞侵袭、迁移和转移，发挥抑癌基因的作用。本研究中，肺鳞癌组织中E2F1、E2F6表达水平较癌旁组织均明显上升，提示E2F1、E2F6可能在肺鳞癌中发挥作用。分析肺鳞癌组织中E2F1、E2F6表达水平与临床病理特征的关系，发现肺鳞癌组织E2F1表达与淋巴转移、肿瘤分化程度有关，肺鳞癌组织E2F6表达与肿瘤直径、淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关，且肿瘤低分化程度中E2F6高表达比例更高，这与Zheng等[15]在子宫内膜癌中的研究一致，提示E2F1表达可能与细胞侵袭、分化有关，E2F6表达可能与细胞增殖、侵袭和分化有关。

TPX2表达受细胞周期调控，在有丝分裂期与纺锤体结合时，通过将TPX2靶向附着于纺锤体微管，保证正常的纺锤体极性，其过表达可能会抑制正常的核分裂，干扰其自身激活的生理途径，在癌变、恶性肿瘤进展中发挥作用[16-17]。叶静梅等[6]研究发现，TPX2在小细胞肺癌组织中高表达，可能与小细胞肺癌的发生发展、远处转移有关。本研究结果显示，TPX2在肺鳞癌组织中表达上调，与淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关，提示TPX2可能在肺鳞癌发生中发挥作用，可能与肺鳞癌细胞侵袭、分化有关。肺鳞癌组织中E2F1、E2F6、TPX2表达均呈正相关，提示E2F1、E2F6、TPX2间表达联系密切，可能共同参与肺鳞癌发生发展，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

综上所述，肺鳞癌组织中E2F1、E2F6、TPX2表达均明显上调，且相互呈正相关，均与淋巴转移、肿瘤分化程度有关，可能均参与肺鳞癌细胞侵袭、分化。但由于本研究纳入样本量较少，结果可能具有局限性，下一步将继续收集样本，对E2F1、E2F6、TPX2在肺鳞癌中的作用进一步深入研究，以期为肺鳞癌临床治疗、预后提供更有价值的理论参考。