非小细胞肺癌患者中Th17细胞及IL-17变化与淋巴结转移、不良预后的相关性分析

左秀萍 高苗 宋娟 徐梦 张朋勃 张勇 吴蓉

肺癌是临床常见恶性肿瘤，其发病率正逐年攀升[1]，并趋于年轻化方向发展，现已成为城市肿瘤发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤疾病。据相关调查数据显示，非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌类型的80%[2]，且极易发生远处转移，导致患者生存期缩短。淋巴结转移是常见远处转移之一，在早期可毫无症状，在查体时会发现锁骨上区淋巴结固定、坚硬，可融合，但无痛感，不易引起患者重视，从而导致发现时多进展至晚期，预后极差。促进肿瘤生长、转移的重要原因之一是机体免疫水平降低，而近年来研究结果显示[3]，Th17细胞和IL-17在肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫性疾病中均发挥着重要作用。本文旨在探究NSCLC患者中Th17细胞及IL-17变化与淋巴结转移、不良预后的相关性，为此笔者展开临床对照性研究，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年1月到2018年12月我院收治的NSCLC患者200例，设为研究组，纳入标准[4]：① 符合世界卫生组织(WHO)中NSCLC诊断标准[4]，并经组织病理学检查确诊；② 无合并严重肝肾功能障碍、免疫系统疾病者；③ 未接受任何放疗、化疗、免疫治疗等综合治疗；④ 触诊、CT检查和B超检查结果均显示淋巴结肿大，存在淋巴结转移，判定为淋巴结阳性；⑤ 自愿参与该研究，并签署知情同意书。排除标准：① 临床资料不全者；② 患有类风湿性关节炎、红斑狼疮、多发性硬化症等自身免疫疾病；患有慢阻肺、支气管哮喘等急慢性感染。研究组男144例、女56例；年龄52岁～85岁，平均年龄(67.03±5.24)岁；疾病分型：腺癌91例、鳞状细胞癌109例；肿瘤分期：Ⅰ期39例、Ⅱ期58例、Ⅲ期47例、Ⅳ期56例。依据纳入对象淋巴结转移情况，将研究组中112例存在淋巴结转移患者设为转移组，将88例未出现淋巴结转移患者设为未转移组。其中，转移组男83例，女29例；年龄52岁～85岁，平均年龄(67.14±4.85)岁；疾病分型：腺癌48例，鳞状细胞癌64例；肿瘤分期：Ⅰ期21例、Ⅱ期34例、Ⅲ期24例、Ⅳ期33例。未转移组男61例、女27例；年龄55岁～82岁，平均年龄(66.85±5.32)岁；疾病分型：腺癌43例、鳞状细胞癌45例；肿瘤分期：Ⅰ期18例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期23例。选取同期健康体检者100例，设为对照组，男73例、女27例；年龄67岁～83岁，平均年龄(66.76±3.96)岁。三组患者基线资料比较无显著差异(P>0.05)，具可比性(见表1)。

表1 三组患者一般资料比较

二、方法

试剂：蛋白转运抑制剂Brefeldin(BFA)、Fixation/pormeabilization破膜剂、单克隆抗体：鼠抗人APC-IL17、鼠抗人PerCP-CD3、鼠抗人PE-Cy7-CD4，购于美国Becton Dickinson公司。离子霉素、刺激剂波酯(PMA)，购于美国Sigma公司。人外周血淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲液(PBS)、含10%胎牛血清RPMI1640培养液、人IL-17酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒，购于联科生物科技有限公司。

仪器：流式细胞仪(BD FACSAria)，购于美国Becton Dickinson公司；酶标仪(Elx800)，购于美国BioTek公司；离心机(F2-MC型)，购于美国Beckmman公司；生物安全柜(BSC-1304 ⅡA2)，购于 南京贝登医疗股份有限公司；培养箱(Binder CB 060)，购于北京创诚致佳科技有限公司。

流式细胞检测：使用肝素钠抗凝采血管采集纳入对象患者空腹外周静脉血5mL，使用加样枪吸取250μL全血按照1 ∶3比例与750μL胎牛血清RPMI 1640培养液混匀，再依次加入BFA 10μL/mL，离子霉素1μL/mL和PMA 100ng/mL。上述试剂加入完成后充分混匀，放入5%CO2、37 ℃恒温培养箱培养5h。收集培养好的细胞至流式管中，1500r/min速率离心5min，弃去上清液，留下沉淀细胞待用。向流式管中加入细胞表面染色荧光抗体PerCP-CD3和PE-Cy7-CD4各10μL，室温避光反应15min。加入BD溶血素2mL以溶解红细胞，室温培养10min。1500r/min速率离心5min，弃去上清液，留下沉淀。加入Fixation/pormeabilization破膜剂1mL，室温培养20min。加入PBS洗液2mL，1500r/min速率离心5min，弃去上清液，留下沉淀。加入10μL荧光标记的APC-IL17进行细胞内染色，避光反应30min。加入PBS洗液3mL，1500r/min速率离心5min，弃去上清液，留下沉淀。重复上述操作两次。加入300μL PBS洗液上流式细胞仪进行检测。

ELISA检测：从4 ℃冰箱中取出冻干标准品，平衡至室温。加入相应比例稀释液后上下颠倒混匀，并静置15min以充分溶解冻干标准品，使用前再次混匀。配置不同浓度标准品，然后将标本和不同浓度标准品加入相应板孔，加入相应的生物标记素进行标记，用封板胶纸封住反应孔，置于37 ℃孵育60 min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入生物素化抗体工作液进行反应，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵育60 min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入酶结合物工作液进行反应，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵育30min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入显色剂，37 ℃避光显色20min。加入终止液，微型振荡器上震荡混匀，并立即上机测试。上述所有操作均应按照IL-17 ELISA试剂盒说明书严格执行。

对NSCLC患者进行为期1年的随访记录，了解其预后情况(存活、死亡)。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析，两组定量数据比较采用t检验,多组定量数据比较采用单因素方差分析的方法,多组之间两两比较采用SNK-Q 检验的方法，非正态分布计量资料以中位数(四分位数)[M(Q1，Q3)]表示，比较采用Mann-WhitneyU检验。定性数据比较采用χ2检验，关联性分析采用Pearson方法对数据进行统计学分析，以P<0.05提示差异具有统计学意义。

结 果

一、三组Th17细胞、IL-17水平比较

三组间Th17细胞和IL-17水平差异具有统计学意义(P<0.05)，且转移组Th17细胞和IL-17水平明显高于对照组(P<0.05)，未转移组Th17细胞和IL-17水平明显高于对照组(P<0.05)，转移组Th17细胞和IL-17水平明显高于未转移组(P<0.05)(见图1和图2)。

图1 Th17细胞水平 图2 IL-17水平

二、NSCLC患者不同病理特征的Th17细胞和IL-17水平比较

外周血中Th17细胞和IL-17水平与NSCLC患者分化程度、病理分型、TNM分期密切相关，鳞状细胞癌患者Th17细胞和IL-17水平明显高于腺癌(P<0.05)，低分化程度患者Th17细胞和IL-17水平明显高于中分化和高分化(P<0.05)，Ⅳ期Th17细胞和IL-17水平明显高于Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期(P<0.05)，且分化程度越低、TNM分期越高，Th17细胞和IL-17水平越高(见表2)。

表2 NSCLC患者不同病理特征的Th17细胞和IL-17水平比较

三、NSCLC患者不同预后及淋巴结转移情况的Th17细胞和IL-17水平比较

对纳入研究NSCLC患者进行为期1年的随访，结果发现有56例患者死亡，144例存活。死亡患者Th17细胞和IL-17水平明显高于存活患者(P<0.05)，发生淋巴结转移患者Th17细胞和IL-17水平明显高于未发生淋巴结转移患者(P<0.05)(见表3)。

表3 NSCLC患者不同预后及淋巴结转移情况的Th17细胞和IL-17水平比较

四、相关性分析

Pearson相关分析显示，Th17淋巴细胞与患者预后死亡、淋巴结转移之间的点二列相关系数显著(rs=0.594，P<0.05；rs=0.646，P<0.05)，提示IL-17水平越高，越倾向于预后死亡、淋巴结转移，IL-17水平与患者预后死亡、淋巴结转移之间的点二列相关系数显著(rs=0.473，P<0.05；rs=0.538，P<0.05)，提示IL-17水平越高，越倾向于预后死亡、淋巴结转移。

讨 论

临床研究结果显示[5]，NSCLC患者极易发生脑、骨、腹腔以及远处淋巴结转移，且早期症状具有一定隐匿性，大部分患者确诊时已错过最佳治疗时间进展至晚期，导致疾病预后差、5年生存率甚至不足15%。手术、放化疗、靶向治疗等综合治疗是临床治疗NSCLC的主流方法[6]，对存在远处转移的患者而言，上述治疗手段均难以取得较为满意的临床治疗效果，究其原因与患者自身免疫功能低下密切相关。有研究表明[7]，肿瘤免疫微环境中细胞因子和肺肿瘤细胞的相互作用可促进微血管生成、诱导肿瘤细胞生长和转移，从而促进肿瘤的发生发展。

在机体遭受肿瘤细胞侵犯时，人体免疫系统中自然杀伤细胞(NK)、CD4+T细胞、CD8+T细胞等细胞可发挥抗肿瘤机制效应。临床研究证实[8-9]，在不同细胞因子作用下初始CD4+T淋巴细胞可分化为具备不同功能的T细胞亚群，最为常见的有Treg、Th1、Th2。Th17淋巴细胞是新发现的CD4+T细胞新亚群，主要分泌细胞因子是促炎因子IL-17，具有独立分化及调节机制。既往研究结果显示[10-12]，Th17淋巴细胞与多种炎症性病变、机体防御反应、自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发病和进展密切相关。有研究显示[13-14]，在胃癌、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝细胞癌等肿瘤患者外周血中均可检测到IL-17高度表达和Th17淋巴细胞浸润。

目前，IL-17和Th17淋巴细胞在NSCLC患者肿瘤细胞生长微环境中的作用机制是促进或拮抗尚未有统一的定论，但大部分研究结果显示Th17淋巴细胞可参与肿瘤免疫分泌细胞因子，促进肿瘤新生血管的形成，从而发挥促进肿瘤效应机制[15-16]。动物实验表明[17]，IL-17淋巴细胞在裸鼠内可招募巨噬细胞到肿瘤部位，促进人类宫颈癌的生长。人类肝细胞肝癌研究显示[18]，IL-17淋巴细胞肿瘤浸润可促进新生血管形成，促进肿瘤生长。多发性骨髓瘤患者Th17细胞和IL-17水平升高，并抑制效应免疫功能。本研究结果显示，NSCLC患者外周血中IL-17表达水平和Th17淋巴细胞数量均高于正常对照，存在淋巴结远处转移患者IL-17水平和Th17淋巴细胞数量高于无淋巴结远处转移患者，除此之外，Th17淋巴细胞和IL-17水平与患者病理分型、分化程度、TNM分期密切相关，分化程度越低、TNM分期越高，Th17细胞和IL-17水平越高。提示IL-17和Th17淋巴细胞可在NSCLC患者中高度表达，且其表达水平与患者病理分型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移密切相关。与此同时，亦有部分学者认为Th17淋巴细胞可在肿瘤细胞生长微环境中发挥抗肿瘤效应。其作用机制主要有[19-20]：①Th17淋巴细胞能直接根除肿瘤细胞；②间接抗肿瘤效应：增强肿瘤特异性T淋巴细胞抗肿瘤效应或招募其他肿瘤特异性免疫细胞聚集，启动强大抗肿瘤CD8+T细胞反应。但由于支持Th17淋巴细胞具有抗肿瘤效应的证据均来自动物实验，并不能说明人体内亦存在相同作用机制。淋巴结转移能够让肿瘤细胞扩散到全身各处，加快疾病的进展，是导致不良预后的重要原因。本研究对患者IL-17水平和Th17淋巴细胞数量与患者预后和淋巴结转移情况作了进一步探究。Pearson相关分析显示，患者IL-17水平和Th17淋巴细胞数量与患者预后死亡、淋巴结转移之间的点二列相关系数显著，这可能与IL-17和Th17淋巴细胞能够促进肿瘤微血管生成，加快疾病进程有关，可作为临床预后不良指标。

综上所述，Th17细胞和IL-17在NSCLC患者中呈高表达状态，与患者预后 和淋巴结远处转移有明显相关性，探讨其在淋巴结远处转移中的作用机制对NSCLC疾病的诊断和免疫治疗具有重要意义。