miR-29b/MMP2轴参与慢性阻塞性肺疾病的作用机制研究

凌婵 蒋之 裴异

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种复杂、多维、异质性疾病[1]，已经成为全球第三大死亡原因[2]。气道重塑是COPD的主要病理基础，也是COPD持续发展的关键因素[3-4]。迄今为止，尚无有效的COPD治疗方法和定义早期COPD的全球公认标准[5-7]。因此，迫切需要新的生物标记物用于早期检测COPD，干预疾病进展[8]。研究发现miRNA可调节COPD的病理过程[9-10]。在COPD患者的肺和血浆中均检测到miR-29b的下降[11]，而且miR-29b的水平与肺功能和炎症相关[12]；表明miR-29b可能参与COPD的进展。但是目前miR-29b调控COPD发生的程度和方式尚不清楚。MMP2可破坏肺部结构，参与气道重塑[13-14]。miR-29b可通过与MMP2 3′UTR结合而负调控MMP2[15-16]。故本研究拟进一步研究miR-29b是否能调控MMP2参与COPD的进展及其对肺支气管上皮细胞增殖迁移的影响。

资料与方法

一、实验材料

1 实验动物

SPF级健康SD雄性大鼠30只，体重(200±10)g，购自济南朋悦动物繁育有限公司，合格证号为SCXK(鲁)20140007。所有动物均严格按照动物饲养规则喂养，温度为24～26 ℃，湿度为50～60%，自由饮水和摄食。饲养3d充分适应环境后开始实验。

2 试剂及仪器

芙蓉王香烟(焦油11mg，烟气烟碱1.2mg，烟气一氧化碳11mg，湖南中烟工业公司)；脂多糖(LPS，美国Sigma公司)；HE染色试剂、RIPA裂解液和BCA试剂盒购自上海碧云天生物科技公司，批号分别为C0105、P0013B、P0012S；大鼠MMP2 ELISA试剂盒(美国Abnova，KA0393)购自武汉艾美捷科技有限公司；miRNA提取分离试剂盒、反转录试剂盒及Real-time PCR试剂盒购买于日本TaKaRa公司；Lipofectamine 2000购买于美国Invitrogen公司；PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；兔抗人MMP2(ab92536)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)均购自英国abcam公司；miR-29b模拟物(mimics)、miR-29b抑制剂(inhibitor)、mimics-NC、inhibitor-NC均由上海Gene Pharma合成；16HBE(人支气管上皮样细胞)(美国ATCC)购自上海恒远生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640培养基均购自美国GIBCO公司；细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司；PFT型小动物肺功能测定仪购自美国Buxco公司；iMark680多功能酶标仪、蛋白转膜装置购自美国Bio-Rad公司、BX51电动显微镜购自日本Olympus公司。

二、方法

1 动物分组及模型制备

采用随机数字表法将30只SD雄性大鼠分为空白组和COPD模型组，每组15只。采用LPS气道滴入联合烟雾法复制COPD大鼠模型[17]。空白组大鼠于正常环境下喂养，COPD组大鼠于实验开始的第1d气管内注入1mL的LPS溶液(100μg的LPS溶于0.5mL PBS)，每周1次，连续6周；并且在每周的其余6d，将大鼠置于自制熏烟箱(有机玻璃，长宽高分别为80cm×80cm×80cm)进行人为被动吸烟，每2次/d，每次0.5h，间隔8h，每次12支香烟，连续6周。结束后对大鼠进行肺功能和组织病理学检测，模型出现肺功能受损和典型的COPD特征性病理特征，提示模型制备成功。

2 检测指标

(1)肺功能测定

大鼠麻醉后，脱去颈部毛发，于颈部正中间皮肤剪一纵行切口，钝性分离皮下肌肉组织，暴露出气管，在靠近咽喉处切一倒T型小口，插管，以仰卧位置于密闭体积描记箱中，使用小动物肺功能测定仪，检测动态肺顺应性(Cdyn)、静息呼吸频率、呼气阻力、吸气峰流速(PIF)。

(2)HE染色观察肺组织形态学变化

取血完成后，打开胸腔，暴露双肺，将左肺放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯1min，蒸馏水冲洗，苏木素染色5min，蒸馏水冲洗，放入1%盐酸酒精30s，蒸馏水冲洗，伊红染色5min，自来水流水洗3次，至无色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察肺组织基本形态。

(3)血浆MMP2含量测定

肺功能测定结束后，采用含肝素的负压管进行腹主动脉取血，离心，取上清液，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中MMP2水平。

(4)qRT-PCR检测肺组织miR-29b表达水平

取出右肺，Trizol法提取总RNA，按照PrimeScript RTMaster Mix说明书将RNA逆转录制备cDNA。按照试剂盒说明书进行PCR扩增：反应体系(25μL)：SYBR® Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL。上下游引物各0.5μL，cDNA(200ng/μL) 1μL，ddH2O 11μL。条件：95 ℃预变性5min，95 ℃变性15s，60 ℃退火延伸1min，进行40次循环，每个样本重复3次，以U6或β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法，计算miR-29b、MMP2的相对表达量(见表1)。

表1 RT-PCR引物序列

(5)细胞培养及转染

人支气管上皮样细胞16HBE接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，隔天换液，每2～3d传代一次，在细胞达到对数增长期时开始实验[18]。取对数期生长的16HBE细胞，转染前1d更换不含抗生素培养基；胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度以1×105个/孔的密度接种于6孔板中。当细胞密度达到约50%至70%时，根据说明使用Lipofectamine 2000转染试剂，将miR-29b mimics、mimics-NC、miR-29b inhibitor、inhibitor-NC转染试剂混合液分别逐滴加入16HBE细胞培养6孔板中，轻轻混匀。混匀后加入到含胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃和5%CO2培养箱分别培养24h。转染试剂的配置：分别取4μg的miR-29b mimics、mimics-NC、miR-29b inhibitor和inhibitor-NC，加入50μL不含血清的RPMI 1640培养基稀释，再加入1μL转染试剂Lipofectamine 2000，室温静置20min。实验设置无任何转染的16HBE细胞为空白对照组(Control组)，每组设置5个复孔。

(6)qRT-PCR检测16HBE细胞miR-29b表达水平

转染24h后采用Trizol法提取16HBE细胞总RNA，然后根据2.2.4项下步骤进行反转录、PCR扩增，计算miR-29b的相对表达量。

(7)CCK-8法检测16HBE细胞增殖

转染24h后，每孔加入10μL的CCK8试剂，于培养箱中继续培养4h。使用酶标仪检测450nm波长下各孔吸光度值(optical density，OD)，并计算各组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD/对照组OD)×100%。

(8)划痕实验检测16HBE细胞迁移能力

取转染24h后的各组16HBE细胞，接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，用移液器尖断在每个孔内划一道痕，每组均设置5个复孔，置于培养箱中继续培养，然后在倒置显微镜下分别在同一位置于0h和48h拍照，观察划痕愈合情况，计算划痕愈合率，实验重复3次。

划痕愈合率(%)=(1-48h划痕宽度/0h划痕宽度)×100%

(9)Western Blot检测各组细胞中MMP2蛋白表达

取转染24后的各组16HBE细胞，按照试剂盒说明书的操作提取细胞中的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(MMP2，按1 ∶1 000的比例稀释；β-actin按1 ∶2 000的比例稀释)，4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)室温孵育1h，化学发光法(ECL)显色，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

三、统计学分析

结 果

一、COPD大鼠肺功能测定结果

与空白组相比，COPD组大鼠动态肺顺应性、吸气峰流速显著降低，呼吸频率、呼气阻力明显升高(P<0.05)，表明COPD组大鼠存在阻塞性肺通气障碍(见表2)。

表2 COPD模型大鼠肺功能检测结果

二、COPD大鼠肺组织形态学变化

HE染色结果显示，空白组大鼠肺组织及肺泡结构正常，无代偿性肺气肿形成；COPD组大鼠肺泡结构明显被破坏，肺泡间隔增宽，肺泡璧变薄，部分断裂融合，形成代偿性肺气肿，可见大量炎性细胞浸润(见图1)。

图1 COPD大鼠肺组织病理学变化(HE染色，×200)

三、COPD大鼠血浆MMP2含量和肺组织miR-29b表达水平

与空白组相比，COPD组大鼠血浆MMP2含量显著升高，肺组织miR-29b表达水平显著降低(P<0.05)(见表3)。

表3 COPD模型大鼠肺功能检测结果

四、16HBE细胞转染后miR-29b表达水平

为了确定转染效果，我们采用qRT-PCR检测16HBE细胞转染后miR-29b表达水平，结果显示，与Control组相比，mimics-NC组和inhibitor-NC组16HBE细胞中miR-29b表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，miR-29b mimics组细胞中miR-29b表达水平显著增加(P<0.05)，miR-29b inhibitor组细胞中miR-29b表达水平显著降低(P<0.05)(见表4)。

表4 转染后16HBE细胞中miR-29b表达水平

五、miR-29b对16HBE细胞增殖的影响

与Control组相比，mimics-NC组和inhibitor-NC组细胞增殖无明显统计学差异(P>0.05)，miR-29b mimics组细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05)，miR-29b inhibitor组细胞增殖并未受到抑制，16HBE细胞增殖反而增加(P<0.05)(见表5)。

表5 miR-29b对16HBE细胞增殖的影响

六、miR-29b对16HBE细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与Control组相比，mimics-NC组和inhibitor-NC组的划痕愈合率无明显统计学差异(P>0.05)，miR-29b mimics组的划痕愈合率显著降低(P<0.05)，miR-29b inhibitor组的划痕愈合率显著增加(P<0.05)(见表6、图2)。

图2 miR-29b对16HBE细胞迁移能力的影响(划痕实验)

表6 miR-29b对16HBE细胞迁移能力的影响

七、miR-29b对16HBE细胞MMP2蛋白表达的影响

Western Blot结果显示，与Control组相比，mimics-NC组和inhibitor-NC组MMP2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-29b mimics组16HBE细胞中MMP2蛋白表达显著降低(P<0.05)，miR-29b inhibitor组6HBE细胞中MMP2蛋白表达显著增加(P<0.05)(见表7、图3)。

表7 miR-29b对16HBE细胞MMP2蛋白表达的影响

图3 miR-29b对16HBE细胞MMP2蛋白表达的影响

讨 论

COPD的发生,主要是肺部长期暴露在香烟和其它燃料燃烧时产生的烟雾，导致肺部慢性炎症。随着工业化进程的加快，空气污染(如雾霾)频频发生，导致COPD的发病率和死亡率也在不断上升。尽管国内外学者进行了积极的研究，但是针对COPD的诊断和治疗仍没有取得重大进展。因此，迫切需要新的生物标记物用于早期检测COPD，以便于对疾病进行及时干预[19]。

近年来随着对非编码RNA研究的不断深入，人们发现miRNA参与多种疾病的发生发展，如肿瘤、神经性疼痛、肺部炎症等，而且miRNA已经成为肿瘤早期诊断和治疗靶标的生物标志物。最近不少研究发现在COPD患者中也发现有miRNA的异常表达，王美华等[20-21]发现在慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清microRNA-146a、microRNA-155水平显著升高；Tang、Seiko等发现在COPD患者的肺和血浆中miR-29b的表达明显降低[11,22]；而且其表达水平与肺功能和炎症密切相关。动物研究也发现miR-29b在COPD大鼠的肺组织和外周血中均具有较低的表达水平[13]；而且有研究发现在慢性肺病或支气管肺发育不良(BPD)患儿的血浆中miR-29b被抑制，表达降低，且其降低与BPD严重程度呈负相关[23]。以上均表明miR-29b可能参与COPD的气道炎症，血浆miR-29b可作为COPD中疾病严重程度的生物标志物。本研究通过复制COPD大鼠模型，采用qRT-PCR检测miR-29b表达水平，发现COPD大鼠模型肺组织中miR-29b表达水平显著低于正常大鼠，与Tang、Seiko研究结果一致。此外，Esha等发现MMP2在COPD模型大鼠和小鼠肺组织、血浆中的表达会增加[13-14]，本研究ELISA检测结果同样显示COPD模型大鼠血浆中MMP2明显高于正常大鼠，而且COPD大鼠较正常大鼠明显存在阻塞性肺通气障碍和肺组织结构损伤；提示miR-29b和MMP2可能参与COPD的发生、发展。

miR-29b-3p可通过靶向MMP2来调节血管平滑肌细胞钙化和成骨分化[24]；Chen等[25]发现miR-29b mRNA水平的升高，可下调MMP2的表达，减轻多囊卵巢综合征；而且多种研究表明在肿瘤细胞中抑制miRNA-29b，可上调MMP-2，促进癌细胞的增殖，迁移和侵袭，miR-29b可作为肿瘤诊断和预后的新型生物标志物[26]。以上研究均说明MMP2是miR-29b的下游靶标，而且已经过萤光素酶分析验证。但是在COPD中miR-29b是否调控MMP2参与慢性阻塞性肺疾病的进展尚不清楚，故本研究进一步采用人支气管上皮样细胞16HBE为对象，通过干扰16HBE细胞中miR-29b的表达，探究miR-29b对16HBE细胞MMP2表达的影响；因为MMP2是上皮细胞重塑过程中的启动子，可破坏肺部结构，参与气道重塑，所以我们还测试了细胞增殖和迁移的变化。结果显示，miR-29b mimics转染后细胞miR-29b表达水平显著增加，而miR-29b inhibitor转染后细胞miR-29b表达水平显著降低，说明转染成功；CCK-8检测结果显示，miR-29b mimics转染后细胞增殖受到显著抑制，而miR-29b inhibitor转染后细胞增殖并未受到抑制，反而促进了16HBE细胞增殖；Western Blot结果显示miR-29b mimics转染后16HBE细胞中MMP2蛋白表达显著下调，而miR-29b inhibitor转染后6HBE细胞中MMP2蛋白表达显著上调；提示，miR-29b可负调控MMP2参与慢性阻塞性肺疾病的进展。

综上所述，miR-29b可负调控MMP2参与慢性阻塞性肺疾病的进展。我们的发现为COPD的诊断和miR-29b治疗COPD提供了新的可能性。因条件有限本研究只是在动物和细胞水平进行了探究，而且样本量小，此结果尚需要临床研究和大样本进行验证。