HPLC法测定复方大红袍止血胶囊中没食子酸的含量
2021-08-22覃媛媛沈嘉华
覃媛媛，沈嘉华
（楚雄州食品药品检验所，云南 楚雄 675000）
复方大红袍止血胶囊（compound dahongpao zhixue capsules）为云南龙发制药股份有限公司独家品种，是由大红袍、柿蒂两味中药材经提取制成的彝药制剂，功效为收敛止血，用于功能性子宫出血、人工流产术后出血、放取环术后出血、鼻衄、胃出血及内痔出血等（彝医功能主治称为差嫫且凯斯多，斯开色土，卑开塞嘟）。复方大红袍止血胶囊现行标准为局颁标准（国家食品药品监督管理局标准WS-10364
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司；检测器：DAD）；赛多利斯BT125D（0.01 mg）电子分析天平（德国赛多利斯公司）；梅特勒MS304 TS/02（0.1 mg）电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；ELGA 超纯水机（法国威立雅公司）。
1.2 试药 没食子酸对照品（批号111703-201504，含量90.8%）购自中国食品药品检定研究院；复方大红袍止血胶囊（云南龙发制药股份有限公司生产，批号分别为 171104、180105、180509、180908、181001、190102、190103、190104、190105、190106）；阴性对照样品由云南龙发制药股份有限公司提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（5∶95）；检测波长272 nm；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；进样量10 μl；理论板数以没食子酸峰计算应不低于7000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取没食子酸对照品10.09 mg置100 ml 量瓶中，加5%盐酸溶液溶解并稀释至刻度，精密量取5 ml 置50 ml 量瓶中，加5%盐酸溶液稀释至刻度，即得没食子酸质量浓度为9.1617 μg/ml的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液 取本品内容物1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入5%盐酸溶液50.00 ml，称定重量，置水浴中回流水解4 h，放冷，用5%盐酸溶液补足减失的重置，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液 取不含大红袍药材、不含柿蒂药材、不含大红袍和柿蒂药材的阴性样品，按照“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。
2.3 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果发现供试品在与没食子酸对照品主峰保留时间相应的位置上有相同色谱峰出现，且主峰与相邻色谱峰能完全分离，峰形良好，理论板数能达到7000，阴性样品无干扰，见图1。
图1 高效液相色谱图
图1（续）
2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、10、20、30 μl，注入液相色谱仪进行测定。以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标进行线性回归，得没食子酸的回归方程（n=6）为：Y=3150X-1.789，r2=1.0000，结果发现没食子酸在1.832～27.485 μg/ml 范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，平均峰面积为285.55496，RSD 为0.06%，结果表明精密度良好。
2.6 重复性试验 取同一批样品（批号：190101）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件测定，平均含量为0.5963 mg/g，RSD 为1.86%，结果表明本方法重复性良好。
2.7 稳定性试验 取对照品溶液和同一批样品（批号：190101）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、16、12、32、48 h 进行测定，记录色谱图，对照品溶液和供试品溶液没食子酸峰面积RSD 分别为0.38%和1.21%，结果表明对照品溶液和供试品溶液在48 h 内稳定。
2.8 加样回收率实验 称取已知含量的复方大红袍止血胶囊（批号：190101）内容物6 份，0.5 g/份，精密加入相当于样品中所含没食子酸量100%的对照品储备液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。
表1 加样回收率实验结果（n=6）
2.9 样品含量测定 取样品10 批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算10 批样品中没食子酸含量，结果见表2。
表2 样品含量测定结果（mg/粒）
3 讨论
3.1 HPLC 成分确定 《中国药典》2015 年版一部[1]“柿蒂”薄层鉴别项下以没食子酸为对照品，国内外亦有文献报道柿蒂中含有没食子酸[2，3]，虽未查询到文献表明大红袍含有没食子酸，但通过对原药材的检测表明其含有该成分。没食子酸具有较强的抗炎抗氧化作用，能抑制肿瘤形成，同时能通过抑制内皮NO 的生成降低血管松弛，从而起到止血作用[4，5]，故本研究将没食子酸选定为含量测定目标成分。
3.2 检测波长的选择 本文研究对没食子酸进行全波段扫描，结果发现在215 nm 和272 nm 波长处均有吸收，结合紫外响应值大小、色谱峰峰形对称尖锐、阴性无干扰等条件，选择272 nm 作为检测波长。
3.3 流动相的选择 本研究观察了乙腈-水、乙腈-不同浓度磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-不同浓度磷酸溶液等多种不同配比流动相对组分分离、保留时间的影响，结果表明甲醇-水（5∶95）为最佳流动相，能使被测成分与其它成分较好的分离，峰形好，阴性对照无干扰。
3.4 提取方法的选择 参考《中国药典》2015 年版一部[1]中“五倍子”“地榆”“余甘子”“肠炎宁片”“宫炎平片”含量测定项下供试品溶液制备方法，考察了不同溶剂（4 mol/L 盐酸溶液、5%盐酸溶液、50%甲醇、甲醇），不同提取方法（超声、加热回流），不同提取时间（3、4、5 h）的提取效果，最终确定5%盐酸溶液加热回流4 h 为最佳提取方法。
3.5 耐用性考察 本研究对不同厂家、型号色谱柱（色谱柱A：Agilent SB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色谱柱B：Agilent 5 HC-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色谱柱C：Thermo AcclaimTM 120-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm 和色谱柱D：Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm），不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），不同流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）进行了耐用性考察，结果表明文中确定的色谱条件对色谱峰峰形、分离度、理论塔板数影响性不大，耐用性较好。
综上所述，复方大红袍止血胶囊是一个疗效确切、使用广泛的彝药制剂，其检验标准最早收载于《国家药品中药标准》（外科、妇科分册），与现行标准中的检验方法一致，其含量测定均用络合滴定法测定总鞣质含量，本次研究制定的HPLC 法快速、简便、准确、可靠，可用于复方大红袍止血胶囊的质量控制。
