基于IL-6/STAT3 信号通路探讨粪菌移植干预湿热蕴结型肠癌小鼠的作用机制

吴成成，黄海鹏，罗文兵

1.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006；2.新余市中医院，江西 新余 338000；3.分宜县中医院，江西 分宜 336600

肠癌在我国乃至全世界的发生率都比较高，尤其是近些年，其发病率逐年攀升［1-2］。通常肠癌患者的治疗都依靠手术、药物、化疗等方式，然而患者生存率依旧不容乐观［3-4］。在肠癌的患者中，湿热蕴结型占了很大一部分［5］。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是一种新型的治疗肠道疾病的方法，主要通过重新构建肠道微生态，增强机体代谢和免疫来发挥作用［6］。IL-6/STAT3 信号通路通常被认为与各类肿瘤的发展密不可分［7］。FMT 用于治疗湿热蕴结型肠癌并且与IL-6/STAT3信号通路的关系还尚不清楚。因此，本文主要研究FMT 对湿热蕴结型肠癌小鼠IL-6/STATE3 信号通路的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级km 小鼠30 只，6 周龄，体质量20～25 g，雌雄各半，购自武汉万千佳兴生物科技有限公司。

1.2 粪菌制备

收集由捐献者提供的50 g 新鲜粪便，用3～5 倍体积的无菌生理盐水稀释，用搅拌器搅拌后立即放入GenFMTer 智能粪菌分离仪（南京法迈特科技发展有限公司）处理，按说明书操作，全过程在一次性密闭管路中完成，获取粪菌悬液1 h 内进行粪菌悬液灌注。

1.3 实验方法

将小鼠按随机数字表法分为模型组和FMT 组以及对照组。模型组和FMT 组建立湿热蕴结型肠癌小鼠模型，步骤：高糖高脂饲料喂养10 d，然后将小鼠置于高温仓（温度35 ℃，相对湿度85%），每天持续8 h，连续3 d 后以产毒性大肠杆菌（109/mL）灌胃（2 mL/只），24 h 后再灌胃1 次，最后为每只小鼠接种含2×107个/mL 人结肠癌HCT116 细胞和20 μg 微载体的复合物悬液100 μL。对照组正常自由饮食并给予等量生理盐水。造模后，FMT 组每日给予15 g/kg 粪菌剂量灌肠处理，灌肠体积0.2 mL。对照组和模型组给予等体积生理盐水灌肠处理。1周后脱颈椎处死，取出肛缘至回盲部的结直肠做后续检测实验。

1.4 肿瘤体积、肿瘤质量的计算

取小鼠肿瘤组织，测量其长短径，称取其质量，计算肿瘤体积和抑瘤率。肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2/2。

1.5 观察指标

（1）各组小鼠肿瘤体积以及肿瘤质量。（2）采用免疫组织化学法检测各组小鼠直肠组织Ki-67 的表达。（3）采用ELISA 法和Western Blot 分别检测各组小鼠直肠组织IL-6/STAT3 信号通路活化情况。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肿瘤体积以及肿瘤质量

与模型组比较，FMT 组肿瘤体积以及肿瘤质量均小于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 小鼠肿瘤体积与肿瘤质量比较（）

表1 小鼠肿瘤体积与肿瘤质量比较（）

2.2 Ki-67 以及IL-6 的表达

与对照组比较，模型组小鼠Ki-67 以及IL-6的表达均上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，FMT 组Ki-67 以及IL-6 的表达均下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 小鼠直肠组织Ki-67以及IL-6的表达

2.3 各组小鼠直肠组织STAT3、p-STAT3 表达

与对照组比较，模型组小鼠STAT3、p-STAT3表达均上调，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，FMT 组小鼠STAT3、p-STAT3 均下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3，图1。

表3 小鼠直肠组织STAT3、p-STAT3表达

图1 小鼠直肠组织STAT3、p-STAT3表达

3 讨论

近些年来，许多肿瘤标志物被用来对疾病的发展以及预后进行监测，Ki-67 是一种与细胞增殖相关的细胞核抗原，它的表达水平反映了细胞增殖水平的高低，通常在正常细胞中其表达很低甚至没有表达，而在肿瘤细胞中表达却很高［8-9］。临床研究也显示［10-11］，肠癌组织中的Ki-67 呈现高表达，而在癌旁组织中表达明显较低。因此，本研究挑选其作为细胞增殖标志物用于直肠癌的研究。本研究中，模型组小鼠直肠组织中Ki-67 的表达明显比对照组高，表明肠癌模型建立成功。

研究显示［12］，IL-6/STAT3 信号通路与细胞的增殖、分化有关，并且参与到各种实体瘤的发展当中，其作用过程主要是通过IL-6 与其作用靶点结合使蛋白酪氨酸激酶（JAK）二聚体化，进一步促使STAT3 被激活，而STAT3 的异常活化能够加速癌症细胞的增殖，使肿瘤组织不断增大，对癌症的发展具有明显的促进作用。除此之外，IL-6/STAT3通路的高表达可促进耐药蛋白及抗凋亡蛋白表达。本实验同样发现，在湿热蕴结型肠癌小鼠的直肠组织中IL-6/STAT3 通路被异常激活，肿瘤生长迅速，说明IL-6/STAT3 通路与湿热蕴结型肠癌的发展密不可分。

中医指出，大部分肠癌患者通常都会脾虚，脾气的缺失会导致湿气聚集，形成湿毒堆积在肠道内，对患者恢复产生极大阻碍。此外，湿毒在肠癌发展当中会破坏肠道微环境，导致机体肠道环境的紊乱。一般情况下，双歧杆菌属、乳酸菌属等益生菌存在于肠道内，它们能在肠道黏膜上建造起一座生物屏障抵御外来侵害，而肠杆菌属、肠球属是肠道中的正常栖息菌，当肠道平衡被打破，这些正常栖息菌数量会剧增并对肠道生物屏障造成损害，使肠道抵御外来侵害能力变弱，不利于肠癌患者的治疗。FMT 是将含有正常菌种的粪便灌注到患者肠道里从而起到修复肠道环境的一种治疗方式。主要通过修复肠道内环境稳态来发挥其对各种肠道疾病的治疗作用。本研究发现，在使用FMT 治疗后，小鼠的肿瘤体积以及肿瘤质量有了一定程度的下降，说明FMT 对湿热蕴结型肠癌小鼠有一定的疗效，进一步检测肿瘤细胞的增殖以及IL-6/STAT3 通路的激活情况时发现，肿瘤细胞的增殖以及IL-6/STAT3 通路的活化都明显受到了抑制。

综上所述，FMT 对湿热蕴结型肠癌存在一定的治疗效果，其机制可能是通过抑制IL-6/STAT3 通路的激活，进一步降低Ki-67 的表达，从而抑制肿瘤细胞的增长。