民族药翠绿针毛蕨质量标准的研究

魏安华，阮金兰，周道年

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北 武汉 430033；2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北 武汉 430030；3.马应龙药业集团股份有限公司，湖北 武汉 430064

翠绿针毛蕨（Macrothelypteris viridifrons）是土家族常用的药用蕨类植物，属于金星蕨科（Thelypteridaceae）针毛蕨属（Macrothelypteris）植物的一个亚种，广泛分布于长江以南各省，西至四川，南至云南东北部，从海拔起到海拔1 000 m 处均可生存，且在亚洲、澳大利亚、美洲热带及亚热带地区都有分布［1］。翠绿针毛蕨具有清热解毒、利尿、止血等功效，民间常用于治疗咽喉肿痛、出血、肿瘤等疾病［2］。虽然我国南方少数民族地区应用翠绿针毛蕨的历史很久，但由于国内对于蕨类植物的关注度普遍不高，其系统的研究报道相对较少，笔者所在课题组长期以来一直专注于国内药用蕨类植物的研究开发，经前期大量筛选研究发现翠绿针毛蕨是具有显著抗肿瘤药理活性的蕨类［3-4］。本研究以江西九江药材为基础，原芹菜素为对照，从药材性状、鉴别及含量等方面进行系统研究，为该药材的质量标准规范提供参考。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪：HITACHI L-2130；记录仪：T2000P；检测器：HITACHI UV Detector L-2400。电子分析天平：上海梅特勒-托利多公司。超声清洗机：上海冠特超声仪器有限公司。硅胶G 预制薄层板（青岛海洋化工有限公司，批号：20160403）。药材采自江西九江，经九江森林植物标本馆馆长谭策铭鉴定为翠绿针毛蕨Macrothelypteris viridifrons的根茎；原芹菜素对照品（纯度＞98%）：自备。HPLC 级甲醇：天津科密欧化学试剂公司。水为超纯水。其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状

本品呈不规则圆形或扁圆形，短而直立，先端表面红棕色，密被具毛的披针形鳞片，并有弯曲棕色须根。质硬而脆，断面呈不规则棕色，有环列的黄白色维管束。

2.2 显微特征鉴别

本品根茎横切面呈黄白至棕色，可见断续环状排列的黄白色维管束；皮层及髓均由薄壁细胞组成，细胞中含淀粉粒及棕色物；表皮细胞一列，残存棕黄色非腺毛，其内有十余列棕黄色厚壁细胞。本品粉末深黄色至棕色，纤维细长，成束或单个散在；维管束环状排列；可见明显管胞和腺毛；管胞大多为梯纹，长达20～100 μm，狭长形，两端尖斜，管胞之间的纹孔大小不一；薄壁细胞呈长方形或圆形。淀粉粒多数，单粒或复粒，直径1～2 μm，脐点和层纹明显。其中管胞，厚壁细胞，薄壁细胞，纤维，非腺毛，内含物等特征见图1。

图1 翠绿针毛蕨药材粉末特征图

2.3 薄层色谱鉴别

取对照品原芹菜素，加甲醇溶解制成1.0 mg/mL的对照品溶液；另取翠绿针毛蕨药材粉末约1.0 g，加入20 mL 甲醇，于80 ℃下回流提取60 min，过滤后，将滤液浓缩至5 mL 作为供试品溶液；再取翠绿针毛蕨对照药材，同法制成对照药材溶液；按照薄层色谱法（《中国药典》2015 年版四部通则0502）试验［5］，吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以氯仿-甲醇=15∶1 为展开剂进行展开，取出晾干后喷以10%硫酸-乙醇溶液，于120 ℃下烘至斑点显色清晰，样本色谱中供试品溶液在与对照品色谱相应的位置上，显现相同斑点，原芹菜素呈现黄色斑点，Rf 值为0.3，结果见图2。

图2 翠绿针毛蕨药材薄层鉴别图谱（1.原芹菜素对照品；2.翠绿针毛蕨药材；3.对照药材）

2.4 检查

2.4.1 水分 按照水分测定法（《中国药典》2015 年四部通则0832 第二法）烘干法［5］，测定本品药材10 批，结果规定药材水分不得超过11.1 %。

2.4.2 总灰分和酸不溶性灰分 按照灰分测定法（《中国药典》2015 年四部通则2302）项下的总灰分和酸不溶性灰分测定方法［5］，测定本品药材10 批，结果规定总灰分不得过4.0%，酸不溶性灰分不得过2.0%。

2.5 浸出物

按照浸出物测定法（《中国药典》2015 年四部通则2201）项下的浸出物测定方法［5］，以乙醇为溶剂，采用热浸法，测定本品药材10 批，结果规定浸出物不得少于14.5%。

表1 水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物测定结果（%）

2.6 HPLC 含量测定

原芹菜素（结构式见图3）为本品主要化学成分，因此本文通过建立HPLC 测定原芹菜素含量的方法来对翠绿针毛蕨药材进行质量控制。

图3 原芹菜素结构式

2.6.1 色谱条件 色谱柱：Amethyst C18-P（250 mm× 4.6 mm，5 μm），柱前加保护柱；柱温：25 ℃；检测波长：262 nm；以甲醇的水溶液作为流动相，梯度洗脱程序为0 min（30∶70）-40 min（100∶0）；流速：1.0 mL/min。

2.6.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品原芹菜素5.2 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为原芹菜素的标准储备溶液，浓度为0.520 mg/mL，对照品溶液的色谱分离结果见图5（A）。

2.6.3 供试品溶液的制备 精密称取约1.0 g 干燥至恒重的翠绿针毛蕨根茎药材粉末，置50 mL 圆底烧瓶中，加入20 mL 甲醇，80 ℃下回流提取60 min，放冷至室温，甲醇补足失重，摇匀，滤过，滤渣再加入20 mL 甲醇，再回流提取1 次，过滤，合并两次滤液，滤液定容至100 mL 容量瓶，摇匀，即得供试品溶液。进样前用0.45 µm 微孔滤膜过滤。

2.6.4 系统适用性试验 精密吸取供试品和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，按“2.6.1”色谱条件测定，记录色谱图。样品中原芹菜素与其他组分的色谱峰分离度大于 1.5，色谱峰理论板数≥3 000，峰形对称，具体色谱分离结果见图4。

图4 翠绿针毛蕨高效液相色谱图

2.6.5 线性关系考察 采用逐级稀释法，将对照品母液分别稀释至浓度为520.00、260.00、130.00、65.00、32.50、16.25 µg/mL的对照品溶液，以20 µL 注入高效液相色谱仪，记录峰面积，并以进样浓度对峰面积进行回归处理，得到回归方程y=30 277x+202 335（R2=0.999 8），结果表明原芹菜素进样浓度在16.25～520.00 µg/mL 范围内，呈良好的线性关系。

2.6.6 重复性试验 精密称取药材（编号：M-1）粉末约1.0 g，共6 份，分别置50 mL 圆底烧瓶中，按“2.6.3”项下供试品溶液制备方法和“2.6.1”项下色谱条件进行分析，结果原芹菜素平均含量10.66 mg/g，RSD为2.0%。

2.6.7 稳定性试验 精密称取药材粉末约1.0 g，置50 mL 圆底烧瓶中，按“2.6.3”项下供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，精密吸取20 μL，于配制后0、3、6、12、24 h 测定峰面积以考察供试品溶液的稳定性，共考察了24 h，结果表明供试品在24 h 内具有较好的稳定性，RSD 为0.67%。

2.6.8 回收率试验 分别精密称取药材粉末约1.0 g，共6 份，分别加入一定量的原芹菜素标准品，按“2.6.3”项下供试品溶液制备方法和“2.6.1”项下色谱条件进行分析，结果原芹菜素加样回收率为98.9%，RSD=1.9%。

2.6.9 药材含量测定 分别精密称取6 批次的药材粉末各1.0 g，置50 mL 圆底烧瓶中，按“2.6.3”项下供试品溶液制备方法和“2.6.1”项下色谱条件进行分析，各批次药材中原芹菜素的含量见表2，原芹菜素含量范围为10.55～11.13 mg/g。

表2 原芹菜素含量测定结果（n=3）

3 讨论

翠绿针毛蕨主要产自亚洲热带和亚热带、大洋洲东北部和太平洋岛屿等地方，我国已有7 种1 变种，分布于长江流域以南各省区［1-2］。目前针毛蕨属植物相关化学成分及生物活性研究不多见，作为国内药用蕨类植物的主要研究团体，我们长期以来一直专注于国内药用蕨类植物的开发研究，翠绿针毛蕨是我们前期经过大量筛选研究发现的具有显著抗肿瘤药理活性的蕨类，体外研究表明翠绿针毛蕨具有显著的抗肿瘤活性和广泛的抗瘤谱［3］。体内试验也显示翠绿针毛蕨提取物对小鼠肝癌和结肠癌均具有很好抑制作用，以翠绿针毛蕨醇提取物250 mg/kg 灌胃H22 肝癌模型小鼠和C26 结肠癌模型小鼠10 d，肿瘤生长抑制率分别为58.9%和68%，与阳性对照环磷酰胺的效果接近［4］。令人惊喜的是，研究发现翠绿针毛蕨对正常细胞毒性较小，无明显免疫抑制，无血液和肝、肾毒性，具有良好的安全性。从已有化学成分研究来看，翠绿针毛蕨的主要成分是黄酮类化合物，特别是含有B 环非苯环结构的黄酮，即色原酮环己烯酮系列衍生物，该类化合物结构新颖罕见，其抗肿瘤疗效及作用机制已成为学者研究热点［3-4,6-7］。

本试验按照规范的中药材质量标准制定方法建立了翠绿针毛蕨根茎的质量标准［8-9］。其中，通过对翠绿针毛蕨性状和显微特征的描述，以及薄层鉴别中，清晰出现的原芹菜素斑点，能较好地将它与同属其他植物相区分；由检查可知，翠绿针毛蕨药材各指标的控制范围分别为：浸出物含量不低于14.5%，总灰分不得超过4.0%，酸不溶性灰分不得超过2.0%，水分量应低于11.1%。

根据课题组前期研究结果［3,10］，黄酮类成分可能是翠绿针毛蕨的主要活性成分。目前黄酮含量测定方法有紫外分光光度法、HPLC、薄层扫描法以及毛细管电泳法等［11］。本研究建立了HPLC-UV 方法来测定翠绿针毛蕨药材中的原芹菜素，方法简便、快速、可靠。实验中通过紫外的全波长扫描，发现原芹菜素在262 nm 附近具有较大的吸收度且溶剂干扰少，基线平稳，故检测波长设定为262 nm；通过药材提取方法和提取时间的考察，即不同时间的超声波提取和回流提取，结果显示回流提取60 min 是最优的含量测定提取条件；最后通过流动相的考察确定了色谱分离条件，结果表明：当采用不同比例的流动相等度洗脱时无法实现原芹菜素峰与其他物质的分离，而采用甲醇水溶液的梯度洗脱则具有很好的分离效果，分离度大于1.5，理论板数按原芹菜素峰计算，不低于3 000，完全符合《中国药典》的要求。在优化的条件下，能够在40 min 之内测定翠绿针毛蕨药材中原芹菜素，适用于翠绿针毛蕨药材的质量控制。

4 结论

建立民族药质量标准的研究，是安全、有效、合理开发应用民族药的基本保证。本文通过考察试验条件，对翠绿针毛蕨药材的形状、显微、薄层色谱进行研究，同时采用HPLC 法测定原芹菜素含量，简便可靠，分离度高，重现性好。本文建立的方法可用于翠绿针毛蕨的质量控制，可为进一步探讨其抗肿瘤药效学物质基础和更好的开发利用奠定物质基础。