Caspase家族与干眼症的研究进展

吴星镝 徐雯

干眼症是一种常见的眼科疾病，影响着中国21%～30%的人口[1]。根据国际泪膜和眼表协会工作组发布的第2 版干眼系列共识，将干眼定义为一种多因素的眼表疾病，以泪膜内环境不稳定为特征，并伴有眼部不适、视觉障碍等症状。其主要的病理生理机制为泪膜不稳定、泪液渗透压升高，眼表炎症和损伤以及神经感觉异常[2]。造成干眼的原因有很多，核心机制是由泪液高渗透压和泪膜不稳定性所驱动。泪膜的不稳定会导致泪膜局部或弥漫性高渗，从而导致角膜或结膜的浅表上皮细胞的局部或弥散性高渗，刺激上皮细胞和常驻的炎症细胞，通过细胞凋亡等途径造成角膜和结膜中的细胞损伤，进而刺激泪腺和神经性炎症，并伴有炎症性细胞因子释放，基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）活化和结膜上皮的炎症性反应。杯状细胞丢失与细胞高渗和慢性损伤后的慢性炎症和表面细胞凋亡直接相关，进一步导致泪膜的失衡[3，4]。细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，是细胞维持生命活动的重要过程，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一种促使细胞凋亡的蛋白酶，在细胞凋亡机制中处于核心地位[5]。有研究表明炎性Caspases促进细胞焦亡的机制，这是另一种与炎症细胞因子白细胞介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）和白细胞介素18（Interleukin 18，IL-18）分泌有关的主要溶解性细胞死亡模式[6]。近年来关于Caspase家族的生化特征及其在干眼症的发病机制中的作用等研究有较大进展。笔者就Caspase家族分子结构和特征及其在干眼症的作用作一概述。

1 Caspase的分子结构及特性

1.1 Caspase的分子结构

Caspases是一类进化保守的半胱氨酸依赖的内蛋白酶，具有底物特异性即特异的作用于天冬氨酸残基。迄今为止，至少14种哺乳动物的Caspase已被鉴定，依次命名为Caspase-1～Caspase-14。它是由1个可变大小的氨基末端区域和1个大亚基（约20 kDa）以及1个小亚基（约10 kDa）组成。根据功能可以分为凋亡组（Caspase-2、3、6、7、8、9、10）和炎症组（Caspase-1、4、5、11、12）。前者主要参与凋亡的信号转导，后者主要调控部分炎症因子的释放。此外，Caspase还可分为起始者和执行者。在起始Caspase的氨基末端原域包含1个Caspase募集域（Caspase recruitment domain，CARD）（包括Caspases-1、2、4、5、9、11）和死亡效应域（Death effector domain，DED）（包括Caspases-8、10），这2个子域通过在Caspase和衔接蛋白之间介导蛋白-蛋白的相互作用，诱导Caspase的水解和自活化[7]。然而执行Caspase缺少相应的原域，需要起始Caspases的裂解才能激活。活化的起始Caspase对执行Caspase进行切割并使之激活，被激活的执行Caspase通过水解靶蛋白，引发炎症或凋亡[5]。

1.2 凋亡Caspase的激活机制

根据Caspase的功能可以分为起始者（Caspase 8、9、10）和执行者（Caspase 3、6、7）。Caspase与多数蛋白酶一样在细胞内以无活性酶原（Procaspase）形式存在。起始Caspase是细胞死亡信号转化为蛋白水解活性的关键点，而Caspase二聚化是起始者Caspase激活的关键步骤。起始Caspases在凋亡信号发出后，通过蛋白-蛋白相互作用，形成寡聚复合体，酶原相互接近，局部酶原浓度升高，驱动邻近诱导的二聚化，从而激活Caspase[8]。在外源性凋亡途径中，死亡诱导信号复合物（Death-inducing signaling complex，DISC）的形成是激活Caspase-8、10的关键步骤。外源性凋亡又称死亡受体通路，它是由胞外肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）超家族的死亡配体引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体结合，使受体三聚化并激活，死亡受体通过死亡结构域募集衔接蛋白（如FADD或TRADD）。衔接蛋白通过DED与Procaspase-8、10形成复合体即DISC[9]。Procaspse-8在DISC中局部浓度升高，可发生自我剪接并活化。活化的Caspase-8释放到胞质中激活下游执行Caspase，导致细胞凋亡。激活的Caspase-8能使胞质中的Bid断裂行成tBid，tBid转移到线粒体上，诱导细胞色素C从线粒体释放进入胞质，从而把外源性凋亡途径和内源性凋亡途径联系起来，有效地扩大了凋亡信号[10]。Caspase-8在大多数啮齿动物和人类细胞中广泛表达。一些啮齿动物（小鼠和大鼠）只表达1种外源性途径的起始Caspase-8，但有些啮齿动物（豚鼠和松鼠）和灵长类动物同时拥有Caspase-8和Caspase-10的基因。关于Caspase-10的功能一直存在争论。有研究表明，它能调节自噬和凋亡反应，从而促进NF-κB活化和细胞存活[11，12]，也有研究者提出Caspase-10具有促凋亡的功能[5]。起始Caspase-9参与的是内源性凋亡途径，又称线粒体途径。当发生细胞应激反应时，线粒体膜会出现肿胀、通透性增高，线粒体的通透性转换膜开放，致使位于线粒体内的细胞色素C等物质释放至细胞质中[13，14]。细胞色素C在去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate，dATP）存在的条件下与凋亡蛋白酶活化因子-1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）结合形成1个单体，7～8个单体聚集形成凋亡体，凋亡体通过CARD募集Procaspase-9，经过自我剪切大小亚基之间的链接后被活化[15，16]。执行者Caspase-3和Caspase-7具有高度同源性，它们以无活性的酶原形式存在。上游的Caspase通过剪切它们大小亚基之间的链接，使其活化。活化的执行Caspase可直接水解与细胞凋亡相关的底物蛋白，引起细胞形态和生物化学改变，包括胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体形成和染色体DNA断裂[17]。见图1。

图1.凋亡机制及其标志物TNF-α，肿瘤坏死因子；FADD，Fas相关死亡功能域蛋白；TRADD，肿瘤坏死因子受体1相关死亡功能域蛋白；Apaf，凋亡蛋白酶活化因子Figure 1.Mechanism and markers of apoptosis.TNF-α,tumor necrosis factors;FADD,fas associated death domain protein;TRADD,tumor necrosis factor receptor 1 associated death domain protein;Apaf,apoptotic protease activator.

1.3 炎症性Caspase与焦亡

细胞焦亡又称为细胞炎性坏死，主要通过炎症性Caspase的激活，导致细胞裂解死亡。焦亡“Pyroptosis”一词与细胞凋亡类似，但第一部分用“Pyro”代替，译为火烧或发烧。最初被用来描述促炎细胞死亡，区别于细胞凋亡。凋亡通常被认为是一种非溶解性的，不产生炎症反应的死亡。而焦亡是一种溶解性的死亡，其特征是细胞肿胀、溶解和释放促炎细胞因子和细胞内容物[18，19]。Caspase-1及IL-1β转化酶（IL-1β converting enzyme，ICE），主要负责在人单核细胞中IL-1β的活化。Schneider等[20]在Caspase-1缺陷小鼠中证实了Caspase-1在IL-β分泌中的重要作用，并证明Caspase-1在细胞凋亡中基本不存在。另外，Caspase-1还能促进IL-18的成熟和分泌[17，21]。最近有研究表明，Caspase-1介导的Gasdermin D（GSDMD）的裂解促进了GSDMD膜孔的形成和细胞裂解，从而引起细胞焦亡。这种Caspase-1调控的焦亡常常与IL-1β和IL-18的分泌以及损伤相关分子模式（Damage associated molecular patterns，DAMPs）的释放同时发生[6]。除了Caspase-1，人类的炎症性Caspase家族包括Caspase-4、5，以及小鼠的Caspase-11。虽然这些炎症性Caspase不能将IL-1β和IL-18前体裂解活化，但是他们都被证实能裂解GSDMD并诱导发生焦亡[22]。

细胞焦亡可以分为经典焦亡途径和非经典焦亡途径，细胞受到的刺激不同，所诱发的途径不同，具体如下：①经典焦亡途径：在DAMPs和病原相关分子模式（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）的刺激下，细胞内各模式识别受体作为感受器[Nod样受体蛋白1b（Nod-likereceptor-protein 1b，NLRP1b）、Nod样受体蛋白3（Nod-likereceptor-protein 3，NLRP3）、含半胱天冬酶募集结构域Nod样受体蛋白4（NOD-like receptors family CARD domaincontaining protein 4，NLRC4）、黑色素瘤缺乏因子2（Absent in melanoma 2，AIM2）和热蛋白（Pyrin）]识别这些信号，通过凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein，ASC）与Caspase-1的前体结合，形成多蛋白复合物，使Caspase-1活化。活化的Caspase-1可以对Gasdermin D进行切割，形成含有Gasdermin D（GSDMD）氮端活性域的肽段，诱导细胞膜穿孔，细胞破裂，释放炎性因子和内容物，诱发细胞焦亡；此外，活化的Caspase-1还能对IL-1β和IL-18的前体进行活化，并释放到细胞外，募集炎症细胞聚集，增强局部炎症反应，诱发细胞焦亡[23，24]。②非经典焦亡途径：小鼠的Caspase-11 和人类的同源Caspase-4、5 是非典型焦亡途径的重要组成部分。该途径不需要ASC和炎性小体的参与。革兰性阴性菌的脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）以胞外受体的方式与Caspase的CARD相互作用，激活人的Caspase4、5 或小鼠的Caspase-11。活化的Caspase直接剪切GSDMD，诱发细胞焦亡。另一方面，Caspase-11能诱导NLRP3和ASC的结合体活化，激活Caspase-1，将前体IL-1β转变为成熟的IL-1β释放到细胞外[22，25]。小鼠Caspase-11的激活机制与凋亡执行Caspase相似，而Caspase-1介导的经典途径与起始Caspase更为相似[17]。

2 Caspase与干眼症

2.1 干眼症

干眼症是最常见的眼科疾病之一，它被定义为泪液和眼表的多因素疾病，导致眼部不适、视力障碍和泪膜不稳定的症状，并对眼表造成潜在损害[2]。“炎症的恶性循环”作为干眼症的核心驱动因素，打破恶性循环是治疗干眼症的重要步骤[4]。干眼炎症的恶性循环包括泪膜不稳定、泪液高渗、角膜/结膜细胞凋亡和眼表炎症。内源性和外源性因素对眼表的影响可以加重炎症的恶性循环，最终加剧干眼症[26]。

2.2 凋亡Caspase与干眼症

干眼症与泪膜高渗和眼表炎症密切相关。免疫炎症反应的证据包括炎性细胞密度增加、炎性细胞因子水平升高和促凋亡因子水平升高。眼表炎症与细胞凋亡的关系也一直是研究的热点。Yeh等[27]发现在干眼小鼠模型中TUNEL实验阳性细胞显著增多，且Caspase-3和多聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP ribose polymerase，PARP）的表达显著增加。透射电镜下可见结膜上皮细胞发生与凋亡一致的超微结构形态学改变。这些结果表明细胞凋亡可能在干眼症的发病机制中起关键作用，但凋亡在干眼症中发生的确切途径尚未阐明。Zhang等[28，29]发现干燥环境诱导的小鼠结膜上皮细胞发生凋亡，Caspase-3、8 的表达增加，而Caspase-9 的表达并不增加。外源性注射IFN-γ使它们进一步增加包括Caspase-9。干眼主要通过Caspase-8 介导的外源性途径诱导结膜细胞凋亡，Th-1细胞因子IFN-γ可以通过2条凋亡途径加重结膜细胞的凋亡[28，29]。Brignole等[30-32]发现在干眼症患者的结膜上皮促凋亡标志物（Fas、Fas配体、APO2.7、CD40、CD40 配体）表达明显高于正常眼，且与免疫激活标志物HLA-DR类抗原表达呈正相关。且这些标志物中，HLA-DR、Fas和CD40在干燥综合征干眼患者中表达更高。慢性释放于眼表的促炎介质，通过刺激凋亡的发生，导致上皮细胞发生退化，破坏眼表稳态。过度表达炎症和凋亡相关抗原证实，炎症和细胞凋亡在干眼眼表细胞中有很强的相关性。环孢素A作为一种有免疫抑制剂，能够减少炎症浸润，调节免疫反应和凋亡途径，甚至增加泪液分泌[33]。Brignole等[32]通过用环孢素A治疗干眼患者6个月后，发现细胞促凋亡标记物和炎症反应明显减少。该研究的证据表明，细胞因子Th-1和IFN-γ在干眼结膜中的病理性细胞凋亡中起重要作用，其特征是眼表的Th-1和Th-17 CD4+T细胞浸润增加。眼表炎症和细胞凋亡与干眼症密切相关，眼表炎症与细胞凋亡的关系一直都是研究的重点。Chi等[34]发现在自身免疫性疾病干眼中，眼表上皮在干燥环境刺激下，氧化线粒体DNA通过刺激Caspase-8 和去泛素化酶家族成员BRCC36诱发NLRP3/NLRP6炎症小体的不平衡激活。与NLRP3无关的Caspase-8可以通过NLRP3/NLRP6介导的炎性小体相互调控激活Caspase-1，引起炎症反应。Strong等[35]研究发现，在实验干眼小鼠中，环孢素A滴眼液可显著减少结膜上皮细胞的凋亡和Caspase-3的表达，防止杯状细胞的丢失。抑制细胞凋亡可能是环孢素A治疗干眼症的关键机制之一。

一般情况下，细胞可以通过累积有机渗透调节物来适应高渗环境[36]。眼表高渗是干眼症的重要发病机制之一。Chen等[37]通过干眼小鼠模型，眼表局部应用渗透调节物左旋肉碱（L-carnitine）、甜菜碱（Betaine）或赤藓糖醇（erythritol），可以导致眼表Caspase-3和炎症因子的表达显著下降，有效地抑制细胞凋亡和眼表局部炎症反应。该研究证明局部应用渗透调剂物系统地限制环境诱导的干眼症的进展。Wu等[38]发现眼表局部应用MAP激酶活化蛋白激酶2（Mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2，MAPKAPK2）抑制剂，能有效减少Caspase-3、Caspase-8以及MMP9 等炎症因子的表达，增加杯状细胞的数量，减轻干眼的症状。虽然这些药物在干眼中的抗炎、抗凋亡作用的具体机制尚未完全了解，但是为干眼的发病机制提供新的见解，以及为治疗干眼提供潜在靶点。

2.3 炎性Caspase与干眼症

Bulosan 等[39]在对干燥综合征小鼠的研究中发现，Caspase-11主要在巨噬细胞和树突状细胞中表达，并在发病前在颌下腺中上调，与信号转导因子和转录激活因子的转录活性增强明显相关。活化Caspase-1导致局部组织分泌促炎细胞因子，如唾液中IL-18水平升高，诱导上皮细胞死亡增加。巨噬细胞/树突状细胞中的Caspase-1 和唾液腺微环境中的IFN-γ在上皮细胞死亡中起关键作用。结果表明活化的Caspase-11激活Caspase-1，使下游的IL-1β、IL-18增加，表明炎症性Caspases在干燥综合征发病前促进炎症微环境和影响靶组织上皮细胞死亡增加中起重要作用。NLRP3炎症小体在调节先天或适应性免疫反应中发挥重要作用。许多研究表明，它在许多炎症相关疾病的发生和发展中具有重要意义[40-42]。Baldini等[43]发现P2X7受体、NLRP3炎症小体、Caspase-1和IL-18的表达在干燥综合征患者的唾液腺中显著性增多。结果表明NLRP3-caspase-1-IL18通路参与了原发性干燥综合征的发生。Niu等[44]通过对干燥综合征干眼和非干燥综合征干眼患者的泪液以及结膜细胞进行分析，发现NLRP3 炎性小体的mRNA和蛋白表达在干眼时上调，同时下游炎症相关因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达也显著升高，且在干燥综合征干眼患者中尤为明显。而且这些相关因子的水平与干眼的严重程度相关。这些结果提示NLRP3炎性小体参与干眼炎症的发生和发展。了解与干眼病理相关的NLRP3-caspase-1-IL-1β，IL-18通路有助于阐明参与疾病进展的因素，并促进靶向治疗。泪膜高渗和氧化应激是引起慢性眼表炎症的重要因素。Zheng等[45，46]发现在环境诱导的干眼小鼠中角膜结膜组织中产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），使得NLRP3的表达增加及下游Caspase-1、IL-1β和IL-18水平的显著升高。上述现象在高渗应激诱导的干眼细胞模型和环境引发的干眼患者中同样可见。Zheng等[45，46]认为局部的高渗会让角膜组织产生大量的ROS，从而激活NLRP3炎症体和下游Caspase-1，通过ROS-NLRP3-IL-1β途径引起角膜上皮细胞发生炎症反应，从而引起干眼。然而这项研究仅纳入了水液缺乏型干眼及干燥综合征型干眼，ROS-NLRP3-caspase-1-IL-1β轴信号通路是否在其他类型的干眼症中发挥类似的作用值得更深入的研究。维生素D3的活性代谢物骨化三醇，是公认的运用于眼表的免疫调节物。Dai等[47]发现骨化三醇可能通过激活nrf2抗氧化信号通路来抑制ROS-NLRP3-IL-1β的细胞通路，保护细胞免受高渗引起的细胞毒性。应用骨化三醇治疗显著抑制了炎症小体NLPR3和Caspase-1相关基因的表达和IL-1β的产生。提示骨化三醇具有在起始阶段控制干眼相关的炎症能力。目前干眼免疫治疗的选择包括环孢素A和局部皮质类固醇。局部应用炎性小体抑制剂可以作为目前干眼症治疗的替代治疗之一[42]。

3 小结

干眼症作为一种多种因素眼表疾病，有着较高的发病率。随着对Caspase家族相关研究的深入进展，人们对Caspase家族在干眼症中重要作用的认识也逐步提高。Caspase作为凋亡和焦亡的重要组成部分，贯穿于它们的整个过程，发挥着重要作用。Caspase家族一些成员参与了眼表凋亡和焦亡发生，通过抑制其活性可以有效抑制眼表凋亡、焦亡的发生和改善干眼的症状，但其在不同类型干眼症中的具体作用以及相关机制仍有待进一步研究明确。Caspase的相关研究为干眼症的发病机制增加了新的内容，并为干眼症的药物治疗提供了新的靶点。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明吴星镝：收集查阅文献，参与选题、设计，文章撰写，根据编辑部的修改意见进行修改。徐雯：参与选题，文章内容指导及设计，文章内容审阅及修改，根据编辑部的修改意见进行核修