杀伤细胞免疫球蛋白样受体和人白细胞抗原C基因型特定前葡萄膜炎的关系

王玉青 刘云霞 任桂芳②（滨州市中心血站，滨州256613）

葡萄膜炎是虹膜、睫状体、脉络膜及邻近眼部结构的炎症。它是获得性失明的主要原因之一［1］。急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AAU）占所有葡萄膜炎病例的85%［2-3］。HLA-B27抗原阳性相关急性前葡萄膜炎（HLA-B27 antigen-positive associated with acute anterior uveitis，B27AAU）和特发性急性前葡萄膜炎（idiopathic acute anterior uveitis，IAAU）是AAU最常见的临床病例［4］。临床上对葡萄膜炎的药物治疗多使用免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺、环孢素、甲氨蝶呤、秋水仙碱等。B27AAU和IAAU致病的免疫抑制机制尚不清楚。

自然杀伤（natural killer，NK）细胞作为一种对靶细胞能够直接进行杀伤的淋巴细胞，在细胞免疫方面发挥重要作用。杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）是一种主要表达在NK细胞和部分T细胞表面的受体。KIR基因编码的跨膜蛋白属免疫球蛋白超家族，共有16个成员：8个抑制型，6个激活型和2个假基因。KIR与其配体的结合调控NK细胞和部分T细胞的活性进而发挥其重要的免疫功能［5-6］。虽然大多数KIR的配体并不知晓，目前其配体鉴定最多是人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）C基因。HLA-C基因具有丰富的多态性，依据其第80位氨基酸的差异把HLA-C基因分成2大组：HLA-C1组是携带精氨酸，HLA-C2组携带赖氨酸。已有报道HLAC1可分别和KIR2DL2、2DL3、2DS2结合，HLA-C2可分别和KIR2DL1、2DS1结合来影响NK细胞的活性［7］。

近年来随着对KIR和HLA-C基因研究的不断深入，不同的眼部疾病和炎症性疾病都与KIR和HLAC基因多态性有关，如Vogt-Koyanagi-Harada（VKH）、重度干眼症（dry eye disease,DED）、原发性Sjögren综合征（primary Sjögren syndrome，SS）以及年龄相关黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）［8-11］等。但迄今未见KIR、HLA-C基因与B27A AU、IAAU关联性的研究报道。本文采用序列特异性引物聚合酶链反应（polymerase chain reaction sequence-specific primer，PCR-SSP）方法就KIR和HLA-C基因型与B27AAU和IAAU的关联性研究报道如下，以为B27AAU和IAAU发生的免疫学机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 资料选取遗传上不相关的确诊为AAU的患者196例以及210例健康者为对照组。患者来自济南市第四人民医院眼科。通过视力、裂隙灯显微镜检查、后段瞳孔扩大检查、x线评价、HLA-B27分型及临床表现确诊。根据葡萄膜炎命名标准化（SUN）工作组的建议，对葡萄膜炎进行了定义和解剖学分类［12］。术语“急性”用于描述以突发性和有限时间（＜3个月）为特征的特定葡萄膜炎综合征的病程。本研究将AAU患者分为B27AAU组和IAAU组。根据与AAU相关的HLA-B27基因分型，对B27AAU进行诊断。IAAU的诊断依据眼科检查，前房细胞有无闪光，无玻璃体细胞，虹膜炎、虹膜睫状体炎、前睫状体炎，无感染性病因。排除基因分型HLA-B27的AAU之外的患者被定义为IAAU组患者。所有患者均无关节炎、口腔或生殖器溃疡病史，并由风湿病学家根据相应标准排除了AS、ReA、SpA和Behçet病（BD）的诊断。有眼部手术史、眼外伤、除葡萄膜炎外的、主要全身疾病（包括糖尿病、肾功能衰竭、肝病、血液学和动脉硬化/心血管疾病）的患者排除在外。196例AAU患者中，男性117例，女性79例，年龄33～51岁，平均年龄43岁。同时从本院健康体检中心抽取210名健康者作为对照组。该组由124名男性和86名女性组成，年龄30～55岁，平均年龄为41岁。研究对象均为山东地区汉族。每个参与者须知情同意，并经济南市第四人民医院委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取EZ Bead system-32 DNA提取工作站（Texas BioGene Inc.）提取血液基因组DNA，严格按照说明书操作。

1.2.2KIR基因检测采用PCR-SSP法对患者和健康者的16个KIR基因进行分型。KIR基因PCR特异性引物序列见表1。（由上海博尚生物技术有限公司合成）。PCR反应体系10µl：包括20 ng的受检基因组DNA、0.2 mmol/L的dNTP、0.5 U的Taq DNA聚合酶（购自Promega）、0.4 µmol/L的引物（除了KIR2DS1的引物为0.8µmol/L外）和1×PCR反应缓冲液。PCR反应参数94℃，4 min；94℃，30 s，65℃，30 s，72℃，90 s，30个循环；72℃，10 min。部分KIR基因PCR扩增的退火温度略有变化：KIR2DS2（63℃）、KIR2DS3（63℃）、KIR2DS4（61℃）和KIR2DS5（63℃）。PCR产物用1～2%琼脂糖凝胶电泳检查，SYNGENE生物图像分析仪进行结果分析。

表1 KIR基因的序列特异性PCR引物Tab.1 Sequence specific PCR primers of KIR genes

1.2.3HLA-C基因型检测采用PCR-SSP法对患者和健康者的HLA-C基因进行分型。HLA-C基因PCR特异性引物序列为C1/C2正向引物:5'-CCGGGGAGCCGCGCA-3',C1反向引物:5'-GCGCAGGTTCCGCAGGC-3',C2反向引物:5'-CGCGCAGTTTCCGCAGGT-3'。PCR反应体系同1.2.2。PCR反应的阳性内对照为生长因子基因（growth hormone gene，GH）。PCR反应参数94℃，120 s；94℃，25 s，70℃，45 s，72℃，30 s，5个循环；94℃，25 s，65℃，45 s，72℃，30 s，21个循环；94℃，25 s，55℃，60 s，72℃，120 s，5个循环；72℃，5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查，SYNGENE生物图像分析仪进行结果分析。

1.3 统计学分析HLA-C和KIR基因的表型频率（phenotypic frequency，PF）通过直接计数测得。用SPSS13.0统计软件进行χ2相关分析，Hardy-Weinberg法则证实样本代表性。P＜0.05为差异有统计学意义。比值比（odds ratio，OR）分析关联强度，用Woolf公式计算（OR=ad/bc），同时计算95%可信区间（95%confidence interval，95%CI）。

2 结果

2.1KIR基因在患者组和健康对照组中的分布在196例AAU患者中，KIR基因的分布没有偏离Hardy-Weinberg平衡（P=0.28）。与对照组相比，B27AAU患者激活KIR2DS2的频率增加（P=0.022，OR=1.77，95%CI=1.08～2.90），然而，在Bonferroni校正后，差异无统计学意义（P=0.067，表2）。与对照组相比，IAAU患者组抑制性KIR2DL2的频率显著增加（P=0.009，OR=2.25，95%CI=1.31～3.85），而抑制性KIR2DL3的频率显著降低（P=0.000，OR=0.03，95%CI=0.00～0.24）。其他KIR基因和基因型在B27AAU、IAAU和对照组之间的分布差异无统计学意义。

表2 AAU患者和对照组KIR基因频率分布［例（%）］Tab.2 Distributions of KIR gene frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

2.2HLA-C基因在患者组和健康对照组中的分布与对照组相比，B27AAU患者的HLA-C1C1基因型频率显著降低（P=0.034，OR=0.55，95%CI=0.35～0.88，表3）。IAAU患者组HLA-C1C2基因型频率较对 照 组 增 加（P=0.043，OR=1.97，95%CI=1.01～3.82），但经Bonferroni校正后，差异无统计学意义（P=0.128）。与对照组相比，B27AAU组HLA-C1等位基因频率显著降低（P=0.009，OR=0.60，95%CI=0.42～0.84），而HLA-C2等位基因频率显著增加（P=0.009，OR=1.68，95%CI=1.19～2.37）。其他HLA-C等位基因和基因型在B27AAU、IAAU和对照组之间的分布无统计学意义（表3）。

表3 AAU患者和对照组HLA-C等位基因频率分析［例（%）］Tab.3 Distributions of HLA-C allele groups′frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

2.3HLA-C基因和其KIR基因受体在患者组和健康对照组中的分布由于目前鉴定KIR的配体最多的是HLA-C分子，因此分析了HLA-C和KIR基因即受体和配体组合的基因型频率在B27AAU和IAAU患者组与对照组中的分布（表4）。HLA-C1等位基因与其已知的KIR配体KIR2DS2与B27AAU的相关性（P=0.019，OR=1.90，95%CI=1.10～3.29），但Bonferroni校正后差异无统计学意义（P=0.058）。与对照组相比，B27AAU患者的KIR2DL1/HLA-C2基因型频率显著增加（P=0.044，OR=1.78，95%CI=1.12～2.83）。HLA-C1等位基因和KIR2DL2、KIR2DL3与IAAU显著相关（P=0.044，OR=2.05，95%CI=1.14～3.66，P=0.001，OR=0.36，95%CI=0.20～0.62）。其他HLA-C和KIR基因型的表型频率在B27AAU、IAAU和对照组之间的分布无统计学意义（表4）。

表4 AAU患者和对照组HLA-C和KIR基因配对基因型频率分布［例（%）］Tab.4 Distributions of HLA-C and KIR gene paired genotype frequencies in AAU patient and control groups［n（%）］

3 讨论

KIR和其相应配体对NK细胞在自身免疫性疾病中发挥重要作用［13-16］。然而，KIR和HLA基因在B27AAU和IAAU发病机制中的作用尚不清楚。本研究是首次报道B27 AAU、IAAU与KIR、HLA-C基因之间的关联。

在本研究中，KIR基因和HLA-C等位基因在B27AAU、IAAU和对照组中分布的频率不同，对照组中KIR基因和HLA-C等位基因的分布与中国汉族人群中的分布相似［9，17］。IAAU组与对照组相比，KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1的频率显著降低，提示KIR2DL3和KIR2DL3/HLA-C1对IAAU有保护作用。KIR2DL3/HLA-C1比其他HLA-C抑制NK细胞的信号较弱，并且可能具有较低的激活阈值［18］。KHAKOO等［19］报道，KIR2DL3/HLA-C1基因型增加了早期丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染的清除率，减弱其抑制功能。与对照组相比，IAAU组的KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1的频率显著增加，提 示KIR2DL2和KIR2DL2/HLA-C1对IAAU敏感。LEVINSON等［20］人报道KIR2DL2/HLA-C1结合增加Birdshot脉络膜视网膜病变的风险。先前的研究表明，KIR2DL2似乎可以抵消KIR2DL3/HLA-C1的清除HCV的保护作用［19］。结果与KIR2DL2/HLA-C1和KIR2DL3/HLA-C1在IAAU组的分布相似。

B27AAU患者的HLA-C1C1基因型 和HLA-C1等位基因频率分别低于对照组，这提示HLA-C1在B27AAU中起保护作用。然而，患者的HLA-C2等位基因频率高于对照组，提示HLA-C2在B27AAU的发病机制中起着不利的作用。此研究结果与前人报道相似：BD患者的HLA-C1频率显著低于健康对照组，而HLA-C2的频率显著高于健康对照组［15］。结果提示，HLA-C1对B27AAU和BD具有保护作用，而HLA-C2与两种眼病的易感风险相关。

KIRs及其配体的结合分析提示KIR2DL1/HLAC2组合与B27AAU呈正相关，HLA-C2与抑制性配体结合时对B27AAU有易感性是由于HLA-C2的易感性。先前的研究表明，B27AAU患者与对照的高加索白人之间KIR2DL1/HLA-C2组合频率差异无统计学意义［21］。结果的不同可能是由于人群的差异造成的。同时也提示KIR与HLA的相互作用与不同的遗传背景有关。

综上所述，本研究分析了KIR基因和HLA-C配体与中国汉族AAU病例的关系，提示KIR和HLA-C基因可以作为1个标记物，为有效治疗疾病提供个性化方案。HLA-C配体与受体结合可能诱导NK细胞活化和抑制AAU进展。KIR受体及其HLA配体的基因分型、表达和功能，以及这些配体和受体在疾病发病中的作用有待进一步研究。