人间充质干细胞外泌体通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路促进小鼠胚胎成骨细胞前体增殖和成骨分化

王新强，吴良邦，章月红，顾增辉

中国人民解放军联勤保障部队第903医院骨三科，杭州 310004

骨质疏松症是60岁以上人群常见的骨代谢疾病，主要特征为骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加，增高了骨折的风险［1］。骨质疏松症主要发生机制是成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收动态失衡，临床上治疗骨质疏松症的药物有骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化促进剂［2］，但这些药物的使用易引发一系列并发症，如非典型骨折和骨坏死［1］。因此，寻找治疗骨质疏松症的新策略尤为重要。

近年研究［3］发现，间充质干细胞（MSC）可通过分泌外泌体参与骨代谢过程，调控骨相关细胞的增殖、分化和凋亡等功能，并且影响骨组织周围微环境，为骨质疏松症等骨代谢疾病的治疗提供了新的思路。BMSC分泌的外泌体可促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）的增殖和分化，促进成骨特异性run相关转录因子2（Runx2）和碱性磷酸酶（Alp）的表达，促进骨矿化沉淀［4］，但外泌体调控的分子学机制尚不清楚。本研究利用差速离心法获得人MSC（hMSC）分泌的外泌体，观察其对MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化的作用，并基于p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

hMSC和MC3T3-E1细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（货号：SCSP-405和GNM15）。PBS、胎牛血清、αMEM培养基和0.05%胰蛋白酶（Gibco，美国）；经典成骨诱导液（赛业生物科技有限公司，广州）；p38MAPK抑制剂SB203580（Selleck生物科技有限公司，美国）；Alp检测试剂盒，Alexa Fluor 488标记的CD90、CD105、CD34和CD45抗体（Abcam公司，英国）；茜素红、SDS-PAGE、RIAP、PMSF、磷酸酶抑制剂和PVDF膜（Solarbio Life Sciences公司，中国）；TRIzol试剂、PrimeScriptTMRT试剂盒和SYBR-Green qPCR Master Mix（TaKaRa公司，日本）；BCA试剂盒（左克生物有限公司，广州）；一抗稀释液、快速封闭液和二抗稀释液（碧云天生物技术有限公司，上海）。Runx2抗体（货号：D1L7F）、Alp抗体（货号：3E5C7）、Ⅰ型胶原蛋白alpha1（COL1A1）抗体（货号：E8F4L）、p38MAPK抗体（货号：D13E1）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗体（货号：D3F9）、ALIX抗体（货号：E6P9B）、CD9抗体（货号：D3H4P）、TSG101抗体（货号：D1O5S）、GAPDH抗体（货号：D16H11）和鼠抗兔二抗（货号：7074）均购自美国Cell Signaling Technology公司，骨桥蛋白（Opn）抗体（货号：ab228748，）购自英国Abcam公司；ECL超敏发光液（四正柏生物科技有限公司，北京）。

1.2 hMSC鉴定

将hMSC接种于60 mm培养皿中，待细胞长至80% ～ 90%融合后，用0.05%胰蛋白酶消化。PBS洗涤3次，500×g离心5 min后，再用PBS制成单细胞悬液。取单细胞悬液200 μL放入玻璃管中，分别加入CD90、CD105、CD34和CD45抗体，放置4℃避光孵育1 h后，再过滤去除细胞聚集体，最后流式细胞仪检测荧光值。

将hMSC种于6孔板内，待长至80% ～ 90%融合后，将培养基更换为成骨诱导液诱导21 d，弃去上清液，PBS洗涤3次，加入4℃多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗涤3次，加入茜素红染色1 h，放入显微镜观察红色结节，并拍照记录。

1.3 hMSC外泌体分离

将hMSC接种于100 mm培养皿中，待细胞长至80%融合后，更换为无血清不含外泌体的αMEM培养基，培养48 h后，收集上清液。用0.22 μm滤膜过滤后，放入超高速离心机通过差速离心法提取外泌体［5］：将过滤的上清液以3 500 r/min、离心半径9.5 cm、离心40 min，将离心后的上清液移至新PC管内，100 000×g离心90 min，弃去上清液；用500 μL PBS冲洗内壁沉淀物，转移至新EP管内，混匀后10 000×g离心60 min；将上清液移至超离心管内，100 000×g离心2 h，收集沉淀物。使用透射电子显微镜观察外泌体形态。通过qNano平台分析外泌体的大小和密度。

1.4 蛋白质印迹法检测hMSC和外泌体中蛋白质的变化

采用裂解液（RIAP∶PMSF∶磷酸酶抑制剂=100∶1∶1）提取hMSC和外泌体中的总蛋白。通过BCA试剂盒检测总蛋白浓度。采用SDS-PAGE电泳分离总蛋白，再转移至PVDF膜上，通过快速封闭液封闭15 min后，TBST洗涤3次，每次10 min。将膜放入1∶1 000稀释的一抗（ALIX、CD9、TSG101和GAPDH抗体）混悬液中，4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次，每次10 min，再放入1∶4 000稀释的二抗混悬液中，孵育2 h。TBST洗涤3次，每次10 min，采用ECL超敏发光液作为显色液，放入化学发光成像仪（Invitorgen公司，美国）进行蛋白显影。通过Image J软件分析结果，相对蛋白表达以GAPDH标准化。

1.5 外泌体对MC3T3-1细胞增殖和成骨能力的影响

将MC3T3-E1细胞种于96孔板内，分为4组，分别给予外泌体5 mg/L［6］干预（外泌体组）、p38MAPK抑制剂SB203580 10 μmol/L［7］干预（抑制剂组）、SB203580 10 μmol/L干预6 h后再加入外泌体5 mg/L干预（抑制剂+外泌体组），以未干预组作为对照组。细胞培养24 h后，将20 μL MTT溶液加入孔内，在37℃孵育2 h。弃去孔内液体，加入150 μL DMSO溶液，放入振荡仪振荡2 min，使用酶标仪490 nm下检测光密度（OD）值，计算与对照组的相对值作为细胞增殖的速率。每个组设3个复孔，实验独立重复3次。

将MC3T3-1接种于6孔板内，待细胞长至40% ～ 50%融合度时，分为对照组、外泌体组、抑制剂组和抑制剂+外泌体组，每3 d换一次含10%胎牛血清的αMEM培养基。21 d后弃去培养基，PBS洗涤3次，加入4℃多聚甲醛固定15 min，加入茜素红染色1 h，放入倒置显微镜观察各组形成的红色钙化结节，拍照记录。

将MC3T3-1接种于6孔板内，分为对照组、外泌体组、抑制剂组和抑制剂+外泌体组，培养24 h后，以1 000 r/min，离心半径9.5 cm，离心10 min，收集上清液。每组均取50 μL上清液放入96孔板内，使用Alp检测试剂盒进行检测。分别加入检测缓冲液和显色底物溶液，避光37℃孵育10 min。每孔加入100 μL反应终止液终止反应，使用酶标仪在405 nm处测定OD值，计算Alp活力。每组6个复孔，独立重复3次实验。

1.6 外泌体对MC3T3-1的mRNA和蛋白质表达的影响

4组细胞干预24 h后，采用TRIzol试剂分别提取各组总RNA。以NanoDrop 2000分光光度计检测各组总RNA纯度和浓度后，将各组的RNA浓度调至一致，再使用PrimeScript TM RT试剂盒反转录扩增为cDNA（反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s）。将目的模板cDNA、SYBR-Green qPCR Master Mix和对应的引物（表1）混合后进行实时荧光定量PCR扩增，条件：95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参，通过2-△△ct法计算目的基因相对表达量。采用蛋白质印迹法测定Runx2、Alp、COL1A1、Opn、p38/p-p38MAPK蛋白相对表达量，方法同前。

表1 实时荧光定量PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences required for real-time fluorescent quantitative PCR

1.7 统计学处理

应用GraphPad Prism 5软件进行数据处理和作图。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hMSC鉴定

流式细胞术检测结果显示，hMSC表面抗原CD90（97.09%）和CD105（99.32%）呈阳性表达，CD34（2.92%）和CD45（1.45%）呈阴性表达，符合BMSC的表面抗原特征（图1a ～ d）。茜素红染色结果显示，hMSC能形成矿化结节，具有诱导成骨能力（图1e）。

图1 流式细胞术和茜素红染色鉴定hMSCFig. 1 Identification of hMSC by flow cytometry and Alizarin Red staining

2.2 外泌体特征

在透射电子显微镜下可见hMSC分泌的外泌体呈球形囊泡，形态为圆形或典型的杯形（图2a），其直径为40 ～ 160 nm（图2b）。蛋白质印迹法检测结果显示，与hMSC比较，外泌体中的ALIX、CD9和TSG101的表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05，图2c）。

图2 hMSC分泌的外泌体特征Fig. 2 Characteristics of exosomes secreted by hMSC

2.3 外泌体对MC3T3-E1细胞中p38MAPK信号通路的影响

蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组相比，抑制剂组和抑制剂+外泌体组中p-p38/p38MAPK的蛋白表达量比值降低，外泌体组中的p-p38/p38MAPK的蛋白表达量比值增加，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图3）；与抑制剂组相比，抑制剂+外泌体组的p-p38/p38MAPK的蛋白表达量比值无明显变化（P＞ 0.05，图3）；与外泌体组比较，抑制剂+外泌体组的p-p38/p38MAPK的蛋白表达量比值降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，图3）。

图3 蛋白质印迹法检测外泌体对MC3T3-E1细胞中p38MAPK信号通路的影响Fig. 3 Effect of exosomes on p38MAPK signaling pathway in MC3T3-E1 cells detected by Western blotting

2.4 外泌体对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组比较，抑制剂组和抑制剂+外泌体组中成骨相关因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量降低，而外泌体组中Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量增加，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图4a、b）；与抑制剂组比较，抑制剂+外泌体组Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量无明显变化（P＞ 0.05，图4a、b）；与外泌体组比较，抑制剂+外泌体组Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，图4a、b）。

茜素红染色和Alp检测结果显示，与对照组比较，抑制剂组和抑制剂+外泌体组矿化结节数量减少、Alp活力降低，而外泌体组的矿化结节和Alp活力增加，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图4c ～ e）；与抑制剂组比较，抑制剂+外泌体组矿化结节数量和Alp活力无明显变化（P＞ 0.05，图4c ～ e）；与外泌体组比较，抑制剂+外泌体组矿化结节数量减少、Alp活力降低，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图4c ～ e）。

图4 hMSC外泌体对MC3T3-E1细胞骨形成的影响Fig. 4 Effect of exosomes from hMSC on MC3T3-E1 cells osteogenesis

2.5 外泌体对MC3T3-E1细胞增殖的影响

MTT结果显示，与对照组比较，抑制剂组和抑制剂+外泌体组的OD值降低，而外泌体组OD值增加，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，图5）；与抑制剂组比较，抑制剂+外泌体组OD值无明显变化（P＞ 0.05，图5）；与外泌体组比较，抑制剂+外泌体组OD值降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05，图5）。

图5 MTT检测外泌体对MC3T3-E1细胞增殖的影响Fig. 5 Effect of exosomes on MC3T3-E1 cells proliferation detected by MTT assay

3 讨 论

目前，全世界大约有2亿人罹患骨质疏松症，其发病率已跃居世界常见病的第7位［8］。骨质疏松症及其并发症（骨折、疼痛和致残等）对人类健康构成了极大威胁［9］。因此，寻找确切有效的防治方案显得非常重要。干细胞治疗的发展为骨质疏松症的治疗带来新的希望。hMSC容易获得，且具有很强的自我更新和多向分化能力，其能定向形成成骨细胞，因此成为“种子细胞”［10］。有研究［11］显示，hMSC直接注入鼠体内后，能使去势大鼠的骨密度增加，可成为骨质疏松症治疗的新型策略。本研究茜素红染色结果显示，hMSC可诱导形成骨细胞，说明hMSC具有成骨分化能力。

然而，hMSC在治疗过程中有免疫排斥防疫及收集过程中细胞受到污染等问题，寻找一种易获得、性状稳定、免疫原性和修复效果好的干细胞尤为重要［12］。近年来，有研究［13］表明，hMSC能分泌出直径30 ～ 160 nm的脂质双分子层细胞外囊泡，即外泌体，囊内含有丰富的蛋白质、脂质和核酸。本研究采用差速离心法分离出hMSC分泌的外泌体，蛋白质印迹法检测显示外泌体中ALIX、CD9和TSG101的表达量较hMSC增加。以外泌体干预MC3T3-E1细胞后，细胞中成骨分化相关因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量增加，矿化结节数量增多，ALP活力和细胞增殖能力增高，表明外泌体能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化和增殖。

有研究［1］表明，p38MAPK信号通路对MC3T3-E1细胞向成骨细胞特异性分化起着重要的正向调节作用，抑制p38MAPK信号通路会使MC3T3-E1细胞成骨分化受阻。本研究结果显示，p38MAPK抑制剂干预MC3T3-E1细胞后，成骨分化相关因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn蛋白和mRNA表达量受到抑制，矿化结节数量、Alp活力和细胞增殖能力也明显降低，也证实p38MAPK信号通路正向调控MC3T3-E1细胞成骨分化和增殖。本研究结果显示，外泌体干预MC3T3-E1细胞后，p-p38/p38MAPK蛋白表达量比值增加，说明外泌体调控p38MAPK信号通路转导；阻断MC3T3-E1细胞中p38MAPK信号通路后，再用外泌体干预，细胞中成骨分化相关因子Alp、Runx2、COL1A1和Opn的mRNA和蛋白表达量、矿化结节数量、Alp活力和细胞增殖能力与抑制剂组无差异，说明外泌体通过p38MAPK信号通路调控MC3T3-E1细胞的成骨分化和增殖。

综上所述，hMSC分泌的外泌体能够促进MC3T3-E1细胞的成骨分化和增殖，其调控机制可能是通过激活p38MAPK信号通路实现的。