多指标综合评价丹参-红花配方颗粒提取工艺*

杜少兵 王鹏飞 高速 李娜 杨蕾 李菁 白吉庆 王小平,2

(1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

近些年来，随着心脑血管疾病发病率的升高，用于治疗此类病症的药物的需求量也在增加，具有活血化瘀，通脉舒络功效的丹参红花药对配伍就可治疗此类病症，且疗效也得到临床认可[1]。中药配方颗粒的研制，是以中医药理论为基础，既尊从数千年汤药水煎的传统，又充分利用现代的仪器设备，并结合了现代的先进技术，最大限度保留水煎煮的有效成分，更重要的是便于调配使用[2-4]。目前丹参-红花在心脑血管疾病中的应用广泛，但其配方颗粒研究甚少；且中药由于化学成分复杂，单独提取与合并提取会导致所含成分的含量甚至化学成分的种类不同而影响其疗效[5-7]，因此，本研究以丹参-红花配方颗粒中的主要有效成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、羟基红花色素A为综合评价指标，优选丹参-红花配方颗粒的最佳提取工艺，为丹参-红花配方颗粒的制备提供参考数据。

1 仪器与试药

1.1仪器 戴安Ultimate 3000全自动高效液相色谱仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)；Discovery DV215CD型双量程电子分析天平(瑞士赛多利斯集团)；Direct-Q 3UV纯化水机(默克密理博)；超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2药材和试剂 丹参、红花药材经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定：丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花；丹酚酸B对照品(批号：111562-201615，质量分数96.2%)，羟基红花黄色素A(批号：111637-201810，质量分数≥93.1%)购自中国食品药品检定研究院；紫草酸(批号：19053003，质量分数≥99.87%)购自森岚科技有限公司；迷迭香酸(批号：BZP0004，质量分数≥98%)购自江西佰草源生物科技有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯)美国默克公司；水为超纯水(自制)；其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1丹参提取工艺参数优化

2.1.1正交试验设计 在预实验基础上，选择对丹参提取影响显著的几个因素：乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取次数(C)提取时间(D)，每个因素设3个水平，因素与水平见表1。

表1 丹参正交试验因素水平表

2.1.2正交试验 取丹参药材5 g，精密称定，按照L9(34)正交试验安排表的因素水平组合浸泡60 min，温浸提取，以迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B三种成分含量的加权平均值为指标，选择最佳工艺参数。

本试验以各成分的药理活性及在质量评价中出现的频次作为差异分配权重系数的依据[8-19]，即迷迭香酸占30%，紫草酸占30%，丹酚酸B占40%，加权平均值=迷迭香酸含量×0.3+紫草酸×0.3+丹酚酸B×0.4。结果见表2，方差分析见表3。

表2 丹参正交试验结果

表3 加权平均值的方差分析

2.1.3正交试验结果分析 由表2，表3表明，4个因素对丹参提取工艺的影响顺序为提取时间(D)>提取次数(C)>乙醇浓度(A)>料液比(B)，单个因素对丹参提取工艺的影响都不显著(P>0.05)。我们初步选择A1B1C3D3，即加6倍量的水浸泡60 min之后，温浸提取3次，每次90 min。

鉴于提取次数与提取时间的水平都已经达到上限，因此，对提取次数和提取时间进行进一步考察。

2.1.4丹参提取次数的考察 取丹参5 g，精密称定，加入6倍量水浸泡60 min之后，分别温浸提取3、4次，每次90 min。结果提取3次时，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量分别为(1.59±0.11)mg·g-1、(3.24±0.03)mg·g-1、(27.88±0.71)mg·g-1；提取4次时，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量分别为(1.21±0.16)mg·g-1、(3.27±0.46)mg·g-1、(26.95±3.80)mg·g-1；由于提取3次时各成分含量与提取4次的无显著性差异(P>0.05)，考虑到成本则选择提取3次为最佳。

2.1.5丹参提取时间的考察 取丹参5g,精密称定，加入6倍量水浸泡60 min之后，分别温浸提取90 min、120 min、150 min，提取3次。结果提取90 min时，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量分别为(1.46±0.13)mg·g-1、(2.62±0.41)mg·g-1、(22.96±2.93)mg·g-1；提取120 min时，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量分别为(1.73±0.09)mg·g-1、(2.98±0.15)mg·g-1、(28.48±4.40)mg·g-1；提取150 min时，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量分别为(1.52±0.09)mg·g-1、(3.16±0.04)mg·g-1、(27.50±1.97)mg·g-1；由于提取120 min时各成分含量与150 min无显著性差异(P>0.05)，考虑到成本则选择提取120 min为最佳。

2.2红花提取工艺参数优化

2.2.1正交试验设计 在预实验基础上，选择对红花提取影响显著的几个因素：料液比(A)、提取次数(B)、提取时间(C)，每个因素3个水平，因素水平见表4。

表4 红花正交试验因素水平表

2.2.2正交试验 取红花药材5 g，精密称定，按照L9(34)正交试验安排表的因素水平组合浸泡60 min之后，温浸提取，以羟基红花黄色素A的含量为指标，选择最佳工艺参数。结果见表5，方差分析见表6。

表5 红花正交试验结果

表6 羟基红花黄色素A的方差分析

2.2.3正交试验结果分析 由表5、表6表明，3个因素对红花提取工艺的影响顺序为料液比(A)>提取时间(C)>提取次数(B)。但各因素对红花提取工艺的影响都不显著(P>0.05)。初步选择A2B3C3，即加8倍量的水浸泡60 min之后，温浸提取3次，每次90 min。

鉴于提取次数与提取时间的水平都已经达到上限，因此，对提取次数和提取时间进行进一步考察。

2.2.4红花提取次数的考察 精密称定红花5 g,加入8倍量水浸泡60 min之后，分别温浸提取3、4次，每次90 min。结果提取3次时羟基红花黄色素A含量为(7.52±0.54)mg·g-1；提取4次时羟基红花黄色素A含量为(0.79±0.22)mg·g-1。由于提取3次羟基红花黄色素A含量与提取4次有显著性差异(P<0.05)，故选择提取3次最佳。

2.2.5红花提取时间的考察 取5 g红花，精密称定，加入8倍量水浸泡60 min之后，分别温浸提取90 min、120 min、150 min，提取3次。结果见表10。结果提取90 min时羟基红花黄色素A含量为(8.55±0.31)mg·g-1；提取120 min时羟基红花黄色素A含量为(8.97±0.32)mg·g-1；提取150 min时羟基红花黄色素A含量为(8.14±1.30)mg·g-1。由于提取120 min羟基红花黄色素A含量与提取150 min次有显著性差异(P<0.05)，故选择提取120 min最佳。

2.3指标成分的含量测定[24]

2.3.1色谱条件 色谱柱:Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈-0.2%磷酸水，梯度洗脱，0～15 min，5%乙腈，15～40 min，5%～10%乙腈，40～130 min，10%～20%乙腈，130～152 min，20%～23%乙腈；柱温:25 ℃；检测波长：288 nm，流速:1 mL/min，进样量5 μL。见图1。

A.混合对照品;B.供试品

2.3.2色谱条件 精密称取羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，加甲醇分别制成浓度为0.170、0.145、0.0442、0.392 mg·mL-1的对照品储备液。取上述对照品储备溶液各200μL，加甲醇定容至5mL的量瓶中，得混合对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 精密吸取2.1.1、2.1.4、2.1.5、2.2.1、2.2.4、2.2.5项下的提取液适量，稀释后用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.4线性关系考察 分别精密吸取上述配制的混合对照品溶液各1，2，5，8，10 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。横坐标为对照品质量(X，μg)，纵坐标为峰面积(Y)，进行线性回归，各成分的线性回归方程分别是Y羟基红花黄色素A=4.2518X+0.0098(r=0.9990)，Y迷迭香酸=25.719X-0.063(r=0.9991)，Y紫草酸=16.932X-0.0031(r=0.9994)，Y丹酚酸B=13.233X0.0183(r=0.9995)，分别在6.680～66.80 ng、5.800～58.00 ng、1.768～17.68 ng、15.68～156.8 ng范围内线性关系良好。

2.3.5方法学考察 经方法学考察，该方法的精密度、稳定性、重复性、加样回收率均符合含量测定要求。

2.4单提和合提的试验 丹参：取丹参15 g，精密称定，加8倍量水浸泡60 min之后，每次温浸120 min，提取3次。结果显示迷迭香酸含量为(1.79±0.06)mg·g-1，紫草酸含量为(3.33±0.13)mg·g-1，丹酚酸B含量为(30.06±0.67)mg·g-1。

红花：红花5 g，精密称定，加8倍量水浸泡60 min之后，每次温浸120 min，提取3次；结果显示羟基红花黄色素A含量为(7.82±0.75)mg·g-1。

丹参-红花药对(15 g～5 g)加8倍量水浸泡60 min之后，温浸提取3次，每次120 min；结果显示迷迭香酸含量为(2.57±0.21)mg·g-1，紫草酸含量为(7.06±1.34)mg·g-1，丹酚酸B含量为(59.69±0.32)mg·g-1；羟基红花黄色素A含量为(5.69±0.20)mg·g-1。

综上所述，合提优于单提，最终选择最佳工艺是丹参-红花药对加8倍量水浸泡60 min之后，温浸提取3次，每次120 min。

3 讨论

传统中药煎煮耗时、携带不便，而中药配方颗粒是参照传统中药煎煮方式，以单味饮片为原料，采用水煎提取后，经过一系列现代加工工艺制备而成的，具有免煎、易服、携带方便等优点[20-22]。

丹参-红花药对具有活血化瘀功效，广泛用于心脑血管疾病[23-26]。现代研究表明，丹酚酸B属于丹参中含量最高的水溶性成分[27]，具有抑制细胞凋亡、抗血小板，促进血管新生等药理作用[28-30]，明显改善小鼠的脑缺血再灌注损伤[31]；迷迭香酸可以较好地清除体内自由基，通过抑制心肌缺血后心肌细胞凋亡的发生来保护心肌缺血损伤[32]；紫草酸具有抗动脉硬化作用，并对心肌细胞有明显的保护作用[33]；红花的主要有效成分为红花黄色素，是一种水溶性混合物。而羟基红花黄色素A在红花黄色素中占的比例最大，并且可以促进血管的生成、抑制细胞凋亡和减少炎症因子的产生[34-36]。故本文主要以丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、羟基红花黄色素A为综合评价指标，优选丹参-红花最佳提取方案。

在丹参的正交设计试验中，起初考虑兼顾到丹参中水溶性成分和脂溶性成分，所以本试验将乙醇浓度设为考察因素。但是在测定过程中，发现脂溶性成分含量很少，甚至在某些因素水平组合中检测不到。所以最终以水溶性成分为评价指标。正交试验结果所选提取次数和时间均为所设水平的上限，所以对提取次数和提取时间进行了进一步考察。

温度对丹酚酸B和羟基红花黄色素A的稳定性影响较大[37-41]，在超过50 ℃时，温度的升高可能导致丹酚酸B成分含量降低[42]，于此同时，红花中的羟基红花黄色素A的稳定性也会受到影响[43]。因此，温浸提取温度不超过50 ℃。

我们此次利用正交试验与单因素试验相结合的方案，筛选出最佳提取方案即8倍量的水对丹参-红花药对进行温浸提取，提取3次，每次120 min。可为丹参-红花配方颗粒的制备提供参考数据。