快速溶剂萃取-高效液相色谱法检测花生中的克百威残留量

周宏霞，王 楠，都 颖，张梅超，倪瑞敏

（威海市食品药品检验检测研究院，山东威海 264200）

克百威、3-羟基克百威等农药常用于花生的种植和生长过程中，它们能防治多种害虫。《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）中规定，花生中克百威的限量为0.2 mg/kg，其中克百威的残留量包含克百威和3-羟基克百威。克百威和3-羟基克百威是广谱性杀虫、杀线虫剂，具有触杀和胃毒作用。它与胆碱酯酶结合不可逆，因此毒性较高[1]。对花生中的克百威残留量进行检测和监控，显得尤为重要。

目前检测克百威的方法有气相色谱法[2-3]、气相色谱-质谱法[4-5]、荧光检测器-高效液相色谱法[6-9]、紫外检测器-高效液相色谱法[10-11]、高效液相色谱-质谱法[12-15]等。目前比较常用的是荧光检测器-高效液相色谱法，该方法灵敏度高，仪器配备要求不高。提取花生中克百威的方法有索氏提取、超声波辅助提取、振荡提取等，但过程烦琐、周期长，不利于大批量检测。快速溶剂萃取是近几年发展起来的一种在高温、高压条件下快速提取固体或半固体样品的前处理方法，具有快速高效的特点，已在多个领域广泛应用[16]。本文采用快速溶剂萃取的方法提取花生中的克百威和3-羟基克百威，用高效液相色谱-柱后衍生法检测。该方法操作简单，自动化程度高，适宜于批量检测工作。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

花生：市售，硅胶，硅藻土，乙腈（色谱纯，thermo），甲醇（色谱纯，thermo），丙酮（色谱纯，thermo），OPA溶液（美国Pickering公司），氢氧化钠溶液（美国Pickering公司），邻苯二甲醛（美国Pickering公司），巯基乙醇（美国Pickering公司），克百威、3-羟基克百威标准品（农业部标准品，浓度100 mg/L），超纯水。

1.2 仪器与设备

分析天平，玻璃研钵和研杵，旋转蒸发仪，快速溶剂萃取仪，带柱后衍生系统的高效液相色谱仪，Mili-Q纯水系统。

1.3 实验方法

1.3.1 液相色谱条件

（1）衍生条件。水解试剂流量0.3mL/min，OPA试剂流量0.3mL/min，水解温度100℃，衍生温度为室温。

（2）色谱条件。C18柱（安捷伦Eclipe Pluse 4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：42 ℃，流量1.0 mL/min进样量：10 µL，流动相：A为甲醇，B为水。梯度洗脱程序：0～10 min时，B由80%降至45%；10～19 min时，B由45%降至20%，19～20 minB由20%升至80%；20～25 minB为80%。激发波长为339 nm，发射波长为445 nm.

1.3.2 快速溶剂萃取条件

溶剂：乙腈；温度：100 ℃；萃取压力：10 MPa；加热时间：300 s；静态时间：180 s；淋洗体积：40%；吹扫时间：100 s；循环次数：3次。

1.3.3 标准溶液配制

准确移取1 mL的克百威、3-羟基克百威标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度得到10 mg/L的标准储备液，用甲醇水溶液（1+1）逐级稀释，得到0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L和 1.00 mg/L标准的工作液。

1.3.4 样品前处理

称取粉碎均匀的花生样品5.0 g和5 g硅胶，放入干净玻璃研钵种充分混合均匀，然后装入33 mL萃取池中，加入1 g硅藻土填满萃取池。装好萃取池后，放入快速溶剂萃取系统中按照1.3.2的条件进行萃取。将萃取液转移至鸡心瓶中，45 ℃下旋转蒸发至近干。用2.5 mL甲醇定容，过0.22 μm的有机滤膜，待上机检测。

2 结果分析

2.1 萃取溶剂的选择

萃取溶剂是影响萃取效率重要因素之一。本实验选用丙酮和乙腈两种有机试剂比对回收率的大小。经过实验发现丙酮提取时，能把花生中的油提取出来，影响定容，并且杂质干扰多。乙腈萃取效果好，回收率高，因此选用乙腈为萃取溶剂。

2.2 流动相的选择

流动相参考（NY/T 761—2008）中用到的甲醇和水，采用等度洗脱时，3-羟基克百威的的保留时间比较靠前，而克百威的保留时间比较靠后，两者的保留时间相差比较大。因此采用梯度洗脱，前期甲醇的比例小，使3-羟基克百威的保留时间拖后，后期甲醇浓度增大，克百威出峰时间提前。这样既能使目标物与杂质分离开来，又能保证一个样品的分析时间不会太长。

2.3 线性范围和检出限

按照1.3.3制备的混合标准溶液，在优化的色谱条件下，以峰面积为纵坐标，3-羟基克百威和克百威的含量（质量浓度）为横坐标，绘制工作曲线，在0.02～1.00 mg/L质量浓度范围内，浓度与色谱峰面积线性关系良好，且相关系数均大于0.999。以信噪比（S/N）的3倍计算检出限，在取样为5 g时，克百威、3-羟基克百威的检出限为0.01 mg/kg。校准曲线方程见表1所示。

表1 2种农药的校准曲线

2.4 精密度和加标回收实验

取空白的花生样品进行加标实验，加标浓度如表2所示，按照1.3.4样品前处理方法对加标样品进行前处理，按照1.3.1色谱条件进行测定，每个加标质量浓度水平平行测定6次。添加回收率实验结果见下表2。

表2 加标回收实验结果

3 结论

本文建立了快速溶剂萃取-高效液相色谱法测定花生中的克百威，该方法操作简单，有机试剂用量少，自动化程度高，适用于批量检测工作。实验结果表明，克百威和3-羟基克百威在0.02～1.0 mg/L浓度范围内线性关系好，相关系数在0.999以上，在0.01～0.10mg/kg加标水平时，回收率为86.3%～97.2%，相对标准偏差为1.22%～4.73%（n=6），方法的检出限为0.01 mg/kg。该方法适用于花生中克百威残留量的检测。