肝细胞癌组织中Foxp3+调节性T淋巴细胞表达水平及其与肿瘤免疫相关性研究

刘冬宇，白 劼，白红艳

(榆林市星元医院检验科，陕西 榆林 719000)

随着社会的发展与环境污染，原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发病率逐年上升，严重威胁患者生命健康[1]。因大多数肝癌患者确诊时已到中晚期，且病灶出现转移与扩散，因此应用手术切除治疗的难度比较大。当前肝癌的发病机制尚不明确，可能与环境因素、长期肝硬化、病毒性肝炎及黄曲霉素等致癌物相关[2-3]。调节性T淋巴细胞(Regulatory T lymphocyte cell,Treg)调控抑制在自身炎症障碍、急慢性感染、过敏、代谢炎症、癌症和自身免疫中发挥着重要的作用，是当前免疫介导炎症负调节的一种重要机制。有研究[4-5]发现，Treg能够诱导局部的免疫耐受，浸润性的Treg对保护性抗肿瘤免疫反应产生抑制，Treg介导抑制可能是当前免疫干预的一个重要靶点，能够阻断Treg介导免疫抑制增强抗肿瘤作用。为了探究肝细胞癌的发病机制，并为肝癌的治疗提供参考，本文选取40例原发性肝细胞癌组织和40例癌旁组织，探讨肝细胞癌中Foxp3+Treg及其与肿瘤免疫的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 40例HCC选自我院经手术切除且病理证实的组织(肝细胞癌组织)，40例HCC患者中男34例，女6例，年龄46～73岁，平均(61.54±2.47)岁。40例癌旁组织选择距离病灶3 cm以外的非癌组织，注意避开坏死区域。病例纳入标准：经病理确诊为肝细胞癌；临床资料完整；术前未经过放化疗等治疗方案。排除标准：合并自身免疫类疾病者；合并其他肝炎病毒感染者；合并酒精性肝病者等。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫组化实验：取 2 ml 肝素抗凝血，加磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至4 ml，然后缓慢加至2 ml Ficoll淋巴分离液上层，2000 r/min 离心 20 min 后吸取单个核细胞。PBS 洗涤后将细胞重悬于 100 μl PBS，与抗体异硫氰酸荧光素(FITC)-CD4 孵育30 min，PBS 洗涤 2 遍后重悬于 500 μl PBS，放入到流式细胞仪中检测其相关数值[6-7]。

1.2.2 免疫组化结果判定：Foxp3+细胞阳性染色镜下观察到细胞核棕黄色或者棕褐色，CD8+T 淋巴细胞阳性染色表现为细胞膜和细胞浆棕黄色或棕褐色着色；先低倍镜下选取 5 个淋巴细胞最丰富的视野，再高倍镜视野下计各细胞的阳性细胞数，结果取5个视野的平均值。同时分别计算同一视野内Foxp3+Treg细胞与CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CD8+CTL)值[8]。

2 结 果

2.1 40例患者临床病理特征与Foxp3+Treg水平的关系 不同性别、肿瘤位置、术前AFP水平、肿瘤病理分级的肝癌患者Foxp3+Treg水平对比无统计学差异(均P>0.05)；不同肿瘤大小的Foxp3+Treg水平对比有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 40例患者临床病理特征与Foxp3+Treg水平的关系(%)

2.2 肝细胞癌组织与癌旁组织CD8+CTL和Foxp3+Treg表达对比 肝细胞癌组织、癌旁组织的Foxp3+Treg、CD8+CTL表达和Foxp3+Treg/ CD8+CTL比值对比差异有统计学意义(均P<0.01)，见表2。

表2 肝细胞癌组织与癌旁组织CD8+CTL和Foxp3+Treg表达对比(%)

2.3 肝细胞癌组织中Foxp3+Treg与CD8+CTL的相关性 见图1。肝癌组织中Foxp3+Treg与CD8+CTL水平呈负相关(r=0.425，P=0.024)，Foxp3+Treg越多，CD8+CTL越少。

图1 肝癌组织中Foxp3+Treg与CD8+CTL比值关系

2.4 肿瘤切除术后Foxp3+Treg水平变化 见图2。术后3个月跟踪监测Foxp3+Treg水平，结果显示，手术后患者外周血中的Foxp3+Treg水平为(5.98±1.34)%，手术前为(9.67±2.25)%，手术后明显低于手术前，差异具有统计学意义(t=5.080，P=0.001)。

图2 肿瘤切除术后外周血Foxp3+Treg比值变化

3 讨 论

人体抗肿瘤免疫效应机制主要包含体液免疫和细胞免疫，而细胞免疫在机体内对抗肿瘤免疫中具有重要作用，而T淋巴细胞是参与其中的主要细胞之一[9]。Treg细胞是抗肿瘤免疫抑制的细胞群体，在正常机体内部各种免疫细胞数量上占有一定比率，如果这个比率失调就会导致免疫耐受或者免疫功能低下，导致肿瘤细胞逃避宿主免疫系统攻击。T细胞有两个主要亚群，分别为CD8+、CD4+T细胞，CD4+T细胞能够依照分泌细胞因子与介导功能分为Th2细胞和Th1细胞，其中Th2细胞分泌IL-10和IL-4等，进而介导体液免疫[10]；Th1主要分泌IFN-γ，对于抗肿瘤免疫具有重要效果。Th2细胞和Th1细胞属于互相调节细胞，IFN-γ会对Th2细胞的功能和分化产生抑制，而IL-10会抑制Th1的功能和分化[11-12]。这种相互平衡的关系会直接对机体免疫功能产生影响，和疾病的发展有着密切关系。相关研究[13]发现，多种肿瘤患者的体内Th2细胞与Th1细胞平衡会出现偏离，多为IL-4上调或IFN-γ下调。还有研究[14]发现，Foxp3+Treg在肿瘤免疫之中发挥了重要作用。因此，为了有效防治肝细胞癌，本文针对于肝细胞癌组织中Foxp3+Treg及其与肿瘤免疫的相关性展开研究。

本研究结果表明，肝癌组织、癌旁组织的Foxp3+Treg、CD8+CTL表达和Foxp3+Treg/ CD8+CTL比值对比差异有统计学意义，由此证明不同组织中Foxp3+Treg、CD8+CTL表达存在统计学差异。有研究[15-16]发现，Foxp3+Treg调控肿瘤免疫主要有两个途径：①通过分泌细胞移植因子，例如IL-10等移植细胞毒性的T细胞(CD8+)与自然杀伤细胞(NK)增殖、活化而发挥出负性免疫调控的作用；②通过细胞和细胞之间的接触直接发挥出细胞的抑制作用。而CD8+CTL细胞在肿瘤的反应之中发挥着巨大作用，局部抗肿瘤的免疫之中处于肿瘤相互作用和机体免疫系统的最前沿，它的功能和数量在一定程度上能够反应机体抗肿瘤的水平和强度，与本研究具有一定相似性[17]；不同性别、肿瘤位置、术前AFP水平、肿瘤病理分级的肝癌患者Foxp3+Treg水平对比无统计学差异，不同肿瘤大小的Foxp3+Treg水平对比有统计学差异，由此证明肝癌患者外周血Foxp3+Treg数量变化和肿瘤大小相关，但是这是否表明Treg和肝癌肝内转移相关，还有待增加样本量深入研究。相关研究[18-20]发现，Foxp3+Treg水平和肝癌的TNM病理分期相关，并且晚期肝癌患者的外周血中Treg水平会高于早期患者，导致这种差异可能是因为其他小组病例选择的时候标准有所不同，可能一些患者已经接受了一部分治疗，导致其免疫功能受到了影响；本研究发现癌组织中Foxp3+Treg与CD8+CTL呈负相关，Foxp3+Treg越多，CD8+CTL越少。相关研究[21]发现，食管癌微环境之中表达活化标志NKG2D的CTL数量和Treg数量呈明显的负相关状态，与本研究结果相同。提示Foxp3+Treg细胞能抑制CD8+CTL细胞的增殖，从而抑制其抗肿瘤作用。而肝癌患者细胞免疫功能较低，可能是因为肝癌患者体内的癌细胞分泌转化生长因子-β(TGF-β)等可溶性因子，导致Foxp3+Treg比值升高，抑制CD8+CTL活化，所以机体杀伤肿瘤细胞能力下降，并且免疫抑制增强，两者联合作用之下导致肝癌患者免疫功能降低，促进肝癌发展[22-23]。术后进行3个月跟踪监测Foxp3+Treg水平，结果显示，手术后患者外周血中的Treg细胞水平为(5.98±1.34)%，手术前为(9.67±2.25)%，手术后明显低于手术前，差异具有统计学意义，由此证明肝癌患者进行根治手术之后，能够清除免疫抑制现象，使患者的免疫功能出现不同程度的恢复，但是这个结论还需要日后增加病例数进行深入研究，从而应用到临床中[24]。

综上所述，肝细胞癌组织中Foxp3+Treg通过抑制CD8+CTL的增殖，可抑制其抗肿瘤作用；通过手术可在一定程度上清除免疫抑制，Foxp3+Treg升高与CD8+CTL降低可能参与肝肿瘤细胞免疫逃逸，因此可以考虑检测Foxp3+Treg与CD8+CTL来评价肝癌患者的细胞免疫功能。