畜禽产品中喹乙醇代谢物残留测定方法优化

蓝棋浩，余军军，宁 军，韦 田，陈秋月

(温氏食品集团有限公司，广东 云浮 527400)

0 引言

喹乙醇又名培育诺、快育灵，是一种化学合成的饲料添加剂，具有促进蛋白同化，提高饲料转化率，加速生长，增加经济效益等作用；同时拥有广谱抗菌效果，所以广泛应用于畜禽和水产品养殖。经研究表明，喹乙醇会在体内存积，对大多数动物有明显的致畸作用。因此，大多数国家都禁止在畜禽与水产品养殖中使用该药，同时在《中国兽药典》(2005版)也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖[1]。

喹乙醇在体内不稳定，能快速代谢成几种物质，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)在体内相对稳定，被公认为喹乙醇代谢残留标识物[2-3]。MQCA的检测方法已有很多文献报道，其中最常用的提取与检测是采用酶解衍生，固相萃取柱净化。该方法存在前处理操作复杂、回收率低、检出限高，不利于大批量检测。通过研究对比，本实验采用2%偏磷酸甲醇(4:1)溶液酸化提取[4]，采用固相萃取柱净化，基质干扰很少，同时回收率在75.4%～105%，检出限达到0.1 μg/kg，大大节省了检测时间，提高了工作效率。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪(ABSCIEX-QTRAP 5500)、电子天平(JJ200)、高速冷冻离心机(Eppendorf-5804R)、纯水机(Rephile-RS2200QSS)、氮吹仪(LabTech-MV5)、多功能振荡仪(IKA-KS501)、超声机(JP-100)、OasisMAX固相萃取柱(150 mg/6 mL，Waters公司)。

3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，纯度99.24%，批号G1012840)；3-甲基喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4)(CATO公司，纯度99.7%，批号B9360028)。

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，氨水和偏磷酸均为分析纯。

1.2 试剂配置

1.2.1 标准储备液配置

精确称取10 mg MQCA标准品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA标准储备液。

1.2.2 内标储备液配置

精确称取10 mg MQCA-D4标准品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 mg/mL MQCA-D4标准储备液，于-20℃下避光保存。

1.2.3 2%偏磷酸甲醇溶液

准确称取20 g偏磷酸到容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，摇匀后2% 偏磷酸与甲醇体积比4:1混匀至烧杯中，即得2%偏磷酸甲醇溶液。

1.2.4 1 mmol/L氨水-甲醇(体积比4:1)溶液

在200 mL水中加入15 μL的浓氨水，混合均匀即得1 mmol/L氨水溶液，再加入50 mL甲醇混匀，即得1 mmol/L氨水-甲醇混合液。

1.2.5 2%甲酸乙酸乙酯溶液

150 mL乙酸乙酯中加入4 mL甲酸，再加乙酸乙酯稀释到200 mL。

1.3 试验方法与结果

1.3.1 样品前处理

称取5 g(精确至0.01 g)均质样品置于50 mL离心管中，加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液，涡旋振荡1 min，超声10 min，水平振荡10 min，9 000 r/min离心5 min，将上清液移入50 mL离心管中，残渣加入8 mL 2%偏磷酸-甲醇提取液重复提取，合并2次提取液，10 000 r/min离心10 min，转移上清液置50 mL离心管，上清液备用。

固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，上清液全部过萃取柱。依次用5 mL水、5 mL 1 mmol/L氨水-甲醇(4:1)溶液、5 mL甲醇淋洗，抽干1 min，用5 mL 2%甲酸乙酸乙酯洗脱，氮气45℃吹干，加入1 mL 0.1%甲酸水：甲醇(9：1，v/v)溶解，漩涡混匀后，经0.22 μm滤膜过滤，上机测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters公司XBridge C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇，流速为0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1；柱温40℃，进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 质谱条件

通过MRM模式，在电喷雾离子源正离子检测模式下进行扫描，分别对MQCA和MQCA-D4进行优化，参照药物的信噪比优化最佳去簇电压和碰撞能量，获得最佳优化条件。源温：550℃，电喷雾电压：5 500 V，碰撞气：Low，气帘气：35 psi，辅助气1：50 psi，辅助气2：50 psi。质谱条件见表2，MQCA色谱图见图1、图2。

表2 其他质谱参数汇总表

图1空白鸡肉色谱图

图2空白鸡肉中MQCA添加浓度为1ng/kg的色谱图

1.3.4 线性方程与检出限

分别配置标准溶液，质量浓度分别为：0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，内标浓度为5 ng/mL进行分析，标准溶液在0.1～20 ng/mL范围内线性范围良好，标准曲线线性方程为Y=0.247 10X-0.010 49(r=0.999 3)。

以加标样本中待测化合物色谱峰的信噪比(S/N)大于或等于3对应的浓度确定方法检出限，当浓度为0.5 ng/mL时，信噪比S/N=97.7，满足要求，故本方法的检出低限为0.1 μg/kg，比国家标准方法中的0.5 μg/kg提高5倍，证明了本方法灵敏度高。

1.3.5 回收率试验及精密度

取空白样品，通过加入不同浓度的标准溶液，使其空白添加浓度为0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg，分别测度其回收率，实验表明，在0.5～2 μg/kg范围内，动物源性食品中MQCA的回收率在75%～105%，批间与批内变异系数均小于10%。回收率及精密度见表3。

2 分析与讨论

2.1 提取方式的优化

由于喹乙醇代谢物在体内是与蛋白质通过结合状态存在的，首先要将喹乙醇代谢物从组织中游离出来。目前文献报道常用的方法有酸解法、碱解法和酶解法[1-7]，并且MQCA有弱酸性，因此偏磷酸溶液能将其游离出来。本实验通过偏磷酸+甲醇[3]混合溶液能使样品中MQCA充分提取出来，再结合超声、振荡，能将其提取效率最大化。

2.2 净化方式的优化

通常净化方式有2种，一种是通过有机溶剂提取和氮气吹干浓缩；另一种是采用固相萃取柱净化浓缩。笔者曾尝试在提取液中加入乙酸乙酯进行萃取[4]，再将有机层氮气吹干，但是基质干扰严重，特别是在猪肝中会出现一个干扰杂锋与目标峰重叠，而且目标峰响应低，无法达到要求，故采用固相萃取法进行净化。

表3 动物源性食品中三种加标浓度回收率及精密度

2.3 固相萃取柱的选择

目前国家标准中均采用混合型阴离子交换固相萃取柱(MAX柱)净化，该萃取小柱能从复杂的样品中提取出酸性化合物保留在柱内，通过酸性有机相溶液洗脱出来，同时该柱pH最佳应用范围在2～8。笔者曾对比过提取液分别为：0.3 mol/L盐酸溶液和2%偏磷酸甲醇混合液提取样品，测试其pH值分别为0.2和2.6，经过MAX小柱净化，浓缩复溶上机测定对比，当提取液为0.3 mol/L盐酸溶液时，回收率为40%～60%；当提取液为2%偏磷酸甲醇混合液时，回收率为75%～98%。因此提取液使用2%偏磷酸甲醇混合液最佳，同时提取液有16 mL，故MAX柱采用高通量的规格(150 mg/6 mL)，避免出现堵塞现象。

3 结论

本方法建立了畜禽产品中喹乙醇代谢物(MQCA)的高效液相色谱-串联质谱法。样品经过酸化提取、净化，有效地消除了基质干扰，方法具有较高的灵敏度，以MQCA-D4作为内标，提高了定量准确性。经过验证，一系列浓度的基质标准溶液(0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL)的标准曲线相关系数r≥0.999；方法检测低限为0.1 μg/kg；在0.5～2 μg/kg添加水平回收率75%～105%，批内与批间变异系数均小于10%。通过回收率和多种食品样品检测表明，该方法前处理简单、便捷，灵敏度高，相比国标GB/T 20746-2006和SNT0197-2014具有灵敏度、回收率高、耗时短等特点，适用于畜禽产品中喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸残留的检测。