香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1群体感应的抑制活性研究

曾桃花, 李文茹, 谢小保, 施庆珊 张建设

香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1群体感应的抑制活性研究

曾桃花1,2, 李文茹2,*, 谢小保2,*, 施庆珊2, 张建设1

1. 浙江海洋大学, 国家海洋设施养殖工程技术研究中心, 舟山 316022 2. 广东省科学院微生物研究所, 华南应用微生物国家重点实验室, 广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州 510070

多种植物精油及其活性成分被证明具有群体感应(quorum sensing, QS)抑制活性, 可以通过抑制病原菌的QS系统, 减弱甚至消除其毒性和致病性。探究香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1 QS系统的抑制活性, 研究香茅醛对QS调控的毒力基因和毒力因子的影响, 对揭示香茅醛的作用机制有一定科学意义。改变香茅醛处理PAO1细胞的浓度与时间, 观察其生长情况, 测定生物被膜、绿脓菌素、弹性蛋白酶、Pseudomonas quinolone signal(PQS)信号分子的产量, 以及用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测QS系统关键基因和相关毒力基因的表达水平。研究发现1.08 mg·mL-1香茅醛不抑制PAO1细胞的生长, 但是显著下调了QS系统关键基因、、、、、和相关毒力基因、、、、、、的表达。1.08 mg·mL-1香茅醛降低了PQS的产量, 对生物被膜的抑制率达到54.4%。2.15 mg·mL-1香茅醛使PAO1细胞培养5 h和24 h时的弹性蛋白酶产量分别减少84.1%和71.6%。0.27 mg·mL-1香茅醛轻微刺激绿脓菌素产生, 0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛减少绿脓菌素的产量。总之, 香茅醛对PAO1具有高效的QS抑制活性, 能下调QS系统关键基因和相关毒力基因的表达水平, 能抑制相关毒力因子的产生, 有潜能开发为高效的群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitors, QSI)。

香茅醛; 铜绿假单胞菌; 群体感应; 毒力因子; 生物被膜

0 前言

抗生素耐药性和抗生素污染问题日益严重, 新一代抗菌药物的新靶标研究受到广泛关注[1–2]。研究发现, QS系统可作为病原菌防治的新靶标[3]。QS是细菌个体与个体之间的一种密度依赖性交流机制, 细菌合成一种被称为自诱导物质(autoinducer, AI)的信号分子, 并不断向环境中释放, AI随着细菌密度的增加而累积, 当累积到一定浓度阈值时, AI可与信号分子受体蛋白结合并启动特定基因的表达, 调控细菌的群体行为来适应环境的变化, 如产生毒素、形成生物被膜和抗生素耐药性等[4]。QSI可以抑制病原菌的毒力和致病力, 但对其生长影响不大, 因而不会为耐药菌提供有利的选择压力[5–6]。铜绿假单胞菌(, PA)是一种条件致病菌, 极易引起烧伤部位、呼吸道、尿道感染, 对健康人影响不大, 但会危及免疫功能低下患者和囊肿性纤维化患者的生命[7]。PA不仅会感染人体, 也会污染水源和食品, 在饮用水和食品中均检出过此菌[8–9]。研究发现, PA对大多数抗生素极易产生耐药性, 很难用传统抗菌药物根除该菌[10–11]。PA生物被膜的形成和绿脓菌素、弹性蛋白酶等毒力因子的产生都受到其QS系统的调控, 可用QSI取代抗菌剂来降低其耐药性[12–13]。QSI抗菌药物的研究对解决PA等致病菌的耐药性问题具有重要意义。

国内外对QSI已有一定的研究, 最早发现天然来源的呋喃酮类和内酯类化合物都有较强的QS抑制活性, 但是它们在产物中含量低且有毒性, 难以广泛投入使用[14–15]。为开发高效低毒的QSI, 研究人员开始对呋喃酮等天然QSI进行化学修饰, 化学合成QSI[16–17]]。同时也在不断寻找新型的天然QSI, 植物来源的QSI具备安全、低毒、环保等优势, 是QSI抗菌药物开发的天然宝库, 研究发现从中草药、生姜、大豆、大蒜、石榴和大叶黄杨中都能提取出QSI活性物质, 而且大多为萜类和黄酮类化合物, 如儿茶素、薄荷醇、6—姜酚等[18–21]。植物精油是从植物的花、叶、根、树皮、果实、种子、树脂等提炼而来, 分子量低、安全、低毒且容易获取, 而且多种精油及其活性成分被报道具有QS抑制活性, 精油类QSI的研究已经引起广泛关注[22–24]。研究表明柠檬烯等多种单萜类精油化合物都能抑制PA的QS系统[25]。香茅醛(3, 7—二甲基—6—辛烯醛)也是一种单萜类化合物, 是香茅()油和桉()叶油的主要成分[26–27], 为一种无色至微黄色液体, 具有柠檬香气和杀虫抑菌活性, 常用来制作香精、驱虫剂和防腐剂, 但暂无其在QS方面的研究[28–30]。

本研究通过检测香茅醛对PAO1 QS系统关键基因和相关毒力基因表达水平的影响, 以及对该菌PQS信号分子、生物被膜、弹性蛋白酶和绿脓菌素等毒力因子的影响, 研究香茅醛的QS抑制活性, 为新型PA防治药物的研发奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂、菌株、培养基与培养条件

香茅醛, 纯度为96%, 相对密度为0.86, 购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 铜绿假单胞菌PAO1由中国科学院南海海洋研究所提供, 本实验室保存; LB液体培养基: 10 g·L-1胰蛋白胨, 5 g·L-1酵母粉, 10 g·L-1NaCl; PAO1在LB液体培养基中180 r·min-1、37℃恒温振荡培养或静置培养。

1.2 实验方法

1.2.1 铜绿假单胞菌菌悬液制备

参考文献[26, 31–32]的方法, 将PAO1细胞在LB液体培养基中振荡培养至对数生长期, 低速离心(4000 r·min-1, 5 min)培养液, 菌体用1×PBS洗涤并重悬, 稀释至(1—2)×108cfu·mL-1, 备用。

1.2.2 生长情况测定

在《微生物学实验》(第4版)中细菌生长曲线制作方法的基础上稍作修改, 比浊测定96孔板中PAO1细胞不同时间段的生长情况[33]。将1.2.1中制备的1—2×108cfu·mL-1指数生长期PAO1菌悬液1: 100加入10 mL LB液体培养基中, 调整起始浓度为1—2×106cfu·mL-1, 处理组再加入不同浓度梯度的香茅醛, 设立空白对照组。取200 μL混合液到96孔板, 每个浓度梯度设3个复孔。37 ℃持续振荡培养72 h, Tecan Spark多功能酶标仪每隔1 h自动检测各孔的OD600值, 分析细菌的生长情况。香茅醛的浓度分别为0、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1。实验重复3次。

1.2.3 群体感应系统关键基因和相关毒力基因的表达水平测定

在100 mL LB液体培养基中加入初始浓度为1—2×108cfu·mL-1的指数生长期PAO1菌悬液和1.08 mg·mL-1的香茅醛, 对照组不加香茅醛, 设立3个平行。振荡培养5 h后, 12000 r·min-1离心培养液, 收集菌体。按照说明书的方法, 用Vazyme Bacteria RNA Extraction Kit从PAO1细胞中提取总RNA, 并用NanoDrop One超微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和质量。使用PrimeScript RT Master Mix将RNA反转录成cDNA, 用SYBR Green Mix进行Real Time PCR反应, 反应分别在ETC811型基因扩增仪和ABI QuantStudio 6荧光定量PCR仪上进行。按照说明书配制10 μL Real Time PCR反应体系(2 × TB GreenII 5 μL; PCR Forward Primer 0.4 μL; PCR Reverse Primer 0.4 μL; ROX Reference Dye II 0.2 μL; cDNA 1 μL;灭菌水3 μL), 每个样品设置4个重复。反应条件如下: 95℃预变性30 s ; 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 34 s ,扩增40个循环。依据NCBI中已测序的PAO1相关基因序列, 用Beacon Designer 7.9软件设计和的基因引物, 引物序列分别为forward: 5′-CTGACAC GGGCTGGATT-3′,reverse: 5′-AGGCGGTTGC TGAAGAT-3′;forward: 5′-CCTTCGCCAACTC GTC-3′,reverse: 5′-TGTCGGTGCCGTCTTC- 3′。其他基因引物参考文献[5]报道的引物序列, 以16S rRNA为内参基因, 委托华大基因合成qPCR引物。实验重复3次。

1.2.4 生物被膜测定

PAO1培养液处理方式同1.2.2, 把添加了混合液的96孔板置于37 ℃恒温培养箱孵育24 h, 采用Li等[5]的方法分别测定加入0(对照组)、0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛之后, PAO1生物被膜的相对含量。简单来说就是将培养液转移到新的96孔板中, 测OD600, 得到悬浮细胞浓度。然后将原96孔板用去离子水冲洗干净并烘干, 0.1% (wt/vol)结晶紫染色10 min, 洗掉染色液, 烘干孔板, 之后加入95%的乙醇脱色, 测OD590。实验重复3次。

1.2.5 绿脓菌素测定

在100 mL LB液体培养基中接入(1—2)×106cfu·mL-1的指数生长期PAO1菌悬液, 处理组再加入香茅醛, 使其浓度分别为0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1, 阳性对照组不添加香茅醛, 用去离子水作阴性对照。培养液37 ℃, 180 r·min-1连续振荡培养7 d, 每隔24 h取5 mL培养液提取绿脓菌素。离心培养液, 取上清, 加入3 mL氯仿抽提绿脓菌素, 并用1 mL 0.2 N HCl反萃取氯仿中的绿脓菌素, HCl层溶液变为红色至深红色, 测其OD520值, 上清液中绿脓菌素的浓度为(μg·mL-1): OD520×17.072[34]。实验重复3次。

1.2.6 弹性蛋白酶活性测定

将(1—2)×108cfu·mL-1指数生长期PAO1细胞接种到100 mL LB中, 37 ℃, 180 r·min-1摇床振荡培养, 分别测定培养5 h和24 h时PAO1的弹性蛋白酶活性。处理组分别加入0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1香茅醛, 阴性对照组用LB培养基提取弹性蛋白酶, 不接种PAO1细胞也不加入香茅醛。离心取0.5 mL上清, 加入10 mg弹性蛋白—刚果红作为底物和1 mL缓冲液(30 mM Tris-HCl buffer, PH 7.2), 37℃振荡反应6 h。加入50 μL 0.12 M的乙二胺四乙酸(EDTA)终止反应, 离心取上清, 测OD495值[35]。弹性蛋白—刚果红被弹性蛋白酶分解后释放出红色物质并溶解在缓冲液中, 在495 nm处有最大吸光度, 可以反应弹性蛋白酶的活性大小[36]。实验重复3次。

1.2.7 信号分子PQS产量测定

PAO1细胞的培养方式和香茅醛处理方法同1.2.3基因表达水平测定, 培养液在37 ℃, 180 r·min-1振荡培养72 h, 每隔24 h, 12000 × g离心培养液5 min, 并收集上清。在20 mL上清液中加入60 mL乙酸乙酯, 涡旋2 min, 使上清与乙酸乙酯充分接触。12000 × g离心上清与乙酸乙酯混合液5 min, 使之分层。将50 mL乙酸乙酯层转移到旋转瓶, 旋蒸, 直至旋转瓶完全干燥, 加入1 mL混合液(酸化乙酸乙酯: 乙腈=1:1)重悬PQS。0.22 μm滤膜过滤PQS重悬液, 进行HPLC分析, 采用Shim-pack GIST C18柱 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), 流动相为甲醇—水(90:10 vol/vol), 流速为1 mL·min-1, 检测339 nm处的波长[6, 37–38]。绘制PQS标准品浓度与峰面积的关系图, 生成标准曲线, 根据样品峰面积, 计算出样品中PQS的产量。实验重复3次。

1.2.8 数据分析

使用软件IBM SPSS Statistics 25.0对实验数据进行检验(student'stest), 分析各处理组与对照组之间的差异,<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 香茅醛对PAO1细胞生长的影响

图1为不同浓度香茅醛处理PAO1细胞之后, 用OD600值绘制的生长曲线, 从图中可看出香茅醛对该菌生长的影响很小。在培养约36个小时之后, 0.27、0.54、1.08 mg·mL-1香茅醛处理组的培养液吸光值均略高于对照组, 此现象的出现可能与低剂量兴奋效应相关[39]。随着香茅醛作用时间增加, 香茅醛有所消耗, 少量的香茅醛反而刺激了细菌增殖。从图1中可看出这种低剂量兴奋效应并不明显, 而且出现在细菌衰亡阶段。因此, 香茅醛不会抑制PAO1细胞的生长。

2.2 香茅醛对PAO1群体感应系统关键基因和相关毒力基因表达水平的影响

1.08 mg·mL-1香茅醛处理PAO1细胞之后, 相较于对照组, PA QS系统的关键基因和相关毒力基因表达水平的变化情况见图2。如图2所示, 共研究了包括QS系统关键基因、、、、、和相关毒力基因、、、、、、在内的13个基因, 发现PAO1细胞经香茅醛处理后, 所有基因的表达水平都不同程度下调, 而且下调倍数都大于2,、、、下调尤其明显。

图1 不同浓度香茅醛处理下的铜绿假单胞菌PAO1生长曲线

Figure 1 The growth curve ofPAO1 treated with different concentrations of citronellal

注: *表示与对照组相比有显著差异, **表示与对照组相比有极显著差异(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 2 Effect of citronellal on the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems ofPAO1

2.3 香茅醛对PAO1生物被膜的影响

细菌静置培养后, 在96孔板内壁形成一圈薄膜, 可以通过结晶紫染色法, 根据OD590值测定生物被膜的相对含量。培养24 h后PAO1细胞生物被膜的形成量如图3所示, 随着香茅醛浓度的增加, 生物被膜的形成量显著减少。处理组对PAO1生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1处理组对生物被膜的抑制率最高, 为54.4%, 但香茅醛对悬浮细胞浓度的影响很小。

注: OD600表示菌悬液浓度, OD590表示生物被膜相对含量。*表示与对照组相比有显著差异, **表示与对照组相比有极显著差异(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 3 Effect of citronellal onPAO1 biofilm

2.4 香茅醛对PAO1绿脓菌素的影响

绿脓菌素的产量结果如图4所示, 从图4(A)可以看出, 在细菌培养的7 d中, 绿脓菌素产量先呈上升趋势, 在第3或4 d达到最大值, 之后一直下降。细菌浓度在第1 d快速增加, 几乎达到最大值, 接着小范围内波动约0.5 d, 之后持续减少。0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛处理组, 7 d都抑制绿脓菌素的产生, 但是无浓度依赖性。PAO1细胞培养的前2 d绿脓菌素产量随香茅醛浓度的增加而减少, 但2.15 mg·mL-1处理组的绿脓菌素产量从第3 d开始高于1.08 mg·mL-1处理组, 1.08 mg·mL-1处理组的绿脓菌素产量从第4 d开始高于0.54 mg·mL-1处理组。此现象与PAO1细胞生长曲线的衰亡期相似, 香茅醛不断消耗, 并呈现出低剂量兴奋效应, 促进细胞增殖, 产生绿脓菌素, 导致绿脓菌素产量与香茅醛处理浓度成正比。同样受到低剂量兴奋效应的作用, 低浓度0.27 mg·mL-1香茅醛第1 d后就轻微刺激绿脓菌素产生。

总之, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛对PAO1绿脓菌素的抑制效果最好, 抑制率高且稳定, 每天的抑制率都高于30%。在绿脓菌素产量最高的第3、4 d, 0.54 mg·mL-1香茅醛对绿脓菌素的抑制率分别为50.1%和46.7%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的抑制率分别为65.7%和40.2%。

2.5 香茅醛对PAO1弹性蛋白酶的影响

从图5可以看出, 不同浓度香茅醛处理PAO1细胞后, LasB弹性蛋白酶的产量明显减少。从图5(A)可知, PAO1细胞培养24 h时的弹性蛋白酶产量为5 h时的数倍, 随着香茅醛浓度增加, 弹性蛋白酶不断减少。2.15 mg·mL-1香茅醛的抑制率最大, 5 h时为84.1%, 24 h为71.6%。可见香茅醛可显著抑制PAO1产生弹性蛋白酶。

2.6 香茅醛对PAO1信号分子PQS产量的影响

用HPLC法测定PAO1的PQS信号分子产量, 结果如图6所示。在细菌培养过程中, PQS产量逐渐增加, 培养72 h时, PQS产量达到最大值。1.08 mg·mL-1香茅醛处理组在处理24、48和72 h时的PQS产量与对照组相比, 均有不同程度的降低, 分别降低了82.0%、82.3%和35.3%。

注: (A)PAO1细胞培养7天中的绿脓菌素的浓度; (B)PAO1细胞培养第3、4天的菌悬液。

Figure 4 Effect of citronellal onPAO1 pyocyanin

注: (A)OD495反应弹性蛋白酶活性; (B)弹性蛋白酶分解弹性蛋白—刚果红并释放出红色物质; *表示与0 mg·mL-1组相比有显著差异, **表示与0 mg·mL-1组相比有极显著差异(* P<0.05, ** P<0.01)。

Figure 5 Effect of citronellal onPAO1 elastase LasB

图6 香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1的 PQS信号分子产量的影响

Figure 6 Effect of citronellal onPAO1 PQS molecules

3 讨论

本研究分别用0.27、0.54、1.08、2.15 mg·mL-1的香茅醛处理PAO1细胞, 发现香茅醛在不抑制PAO1细胞生长的情况下, 能抑制PAO1的QS活性。这与之前QSI的相关研究结果一致, Rasmussen等[40]表示QS系统不直接参与细菌生长的必需过程, 因此QSI不抑制或轻微抑制细菌的生长, 不会给耐药菌提供有利的选择压力。Husain等[19]表明亚抑菌浓度(sub-MICs)下的薄荷()油和薄荷醇能干扰N—酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的革兰氏阴性菌的QS系统。Li等[5]的研究也表明大蒜()精油中的二烯丙基二硫醚可以抑制PA产生毒力因子, 但对其生长无影响。PA至少包含、、三种QS系统, 并呈现出级联调控特点,系统位于调控网络的顶层, 正向调控和系统,系统起连接作用,正向调控系统, 并受系统的反向调节[41]。系统包含N-(3-oxododecanoyl)- L-homoserine lactone(3OC12- HSL)信号分子合成酶LasI和信号分子受体蛋白LasR, 分别由和编码[41–43], 香茅醛处理使和的表达量都显著下调, 该实验结果表明香茅醛抑制了系统中3OC12-HSL信号分子合成酶和信号分子受体蛋白编码基因的表达。和是系统的关键基因, 分别负责编码N-butyryl-L-homoserine lactone(C4- HSL)信号分子合成酶RhlI和信号分子受体蛋白RhlR[41, 44–45]。香茅醛处理使和的表达水平均不同程度的下调, 香茅醛抑制了系统C4-HSL信号分子合成酶和信号分子受体蛋白编码基因的表达。、和编码PQS信号分子的合成, PQS与编码的信号分子受体蛋白PqsR结合, 调控PA的生物被膜、绿脓菌素和弹性蛋白酶[46–47]。香茅醛处理组的和表达水平也显著低于对照组, 香茅醛抑制了PQS信号分子合成酶和受体蛋白编码基因的表达, 与基因表达水平下调一致, PQS的产量也显著降低。以上结果表明, 香茅醛对PAO1的三种QS系统均有明显的抑制作用, 香茅醛的QS抑制机制很可能是通过抑制信号分子合成酶的活性, 进而抑制信号分子的合成, 干扰QS通路的正常生理功能。PAO1细胞经香茅醛处理后, 其QS系统调控的毒力基因、、、、、和的表达水平也都显著下调, 它们分别负责不同毒力因子的合成:(LasA蛋白酶)[41]、(LasB弹性蛋白酶)[41]、(胞外多糖合成酶)[48],(绿脓菌素)[41],(外毒素A)[41],(几丁质酶)[49],(LecB凝集素)[50]。香茅醛处理不仅使PAO1 QS系统调控的毒力基因表达水平下调, 也减少了相关毒力因子的产生, 生物被膜、绿脓菌素、弹性蛋白酶都受到香茅醛的抑制作用。

PA生物被膜难以根除, 极易引起持续性感染, 是该菌产生耐药性的重要原因之一[51]。Pontes等[52]发现香茅精油及其主要成分香叶醇能抑制金黄色葡萄球菌()的生物被膜形成。Cunha等[53]也表示稀释之后的香茅精油对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌()有较低的细胞毒性, 但有较强的生物被膜抑制作用。本研究用香茅精油的主要成分香茅醛处理PAO1细胞, 发现香茅醛对PAO1具有较好的生物被膜抑制效应, 香茅醛处理组对生物被膜的抑制率均大于40%, 1.08 mg·mL-1香茅醛的生物被膜抑制率高达到54.4%。虽然香茅醛同香茅精油和香叶醇一样, 能抑制细菌生物被膜形成, 但香茅醛对革兰氏阴性菌PAO1无杀菌作用, 而香茅精油和香叶醇对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有较强的杀菌作用[52–53]。此现象与Trombetta等[54]发现单萜类化合物对革兰氏阳性菌的抗菌作用比对革兰氏阴性菌强的结论一致。绿脓菌素、弹性蛋白酶都是由PA的QS系统调控的, 是该菌的重要毒力因子[55]。研究表明咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸和香草酸等多种植物的提取物都能抑制PA绿脓菌素的产生[56]。本实验研究了不同浓度香茅醛处理PAO1细胞后, 7 d内的绿脓菌素含量的变化情况, 发现0.54、1.08和2.15 mg·mL-1的香茅醛连续7 d减少了绿脓菌素的产量, 而且抑制率都高于30%, 0.54和1.08 mg·mL-1的香茅醛作用效果最强。LasB弹性蛋白酶主要受系统和基因的调控[41]。香茅醛抑制了PAO1的系统, 下调了的表达水平, PAO1细胞培养5 h和24 h时弹性蛋白酶的产量, 分别减少了84.1%和71.6%。

目前QSI研究还处于实验室研究阶段, 受试菌株基本生长于培养基, 生长条件比较单一, QSI是否能降低病原菌的感染受到关注。孔晋亮等[57]用PAO1菌株感染大鼠腹腔, 相较于PAO1野生菌株, Δ和Δ双突变体PAO1菌株(QS系统缺陷)的生物被膜形成能力大大降低, 大鼠的局部炎性反应减弱, 表明PAO1感染动物后, 与培养基中的PAO1一样, 其毒力因子的产生受QS系统调控, 而且感染能力与毒力基因的表达水平成正比。Haripriyan等[58-59]研究发现丁香精油能抑制PAO1 QS系统毒力基因的表达, 并且能减弱PAO1对秀丽隐杆线虫的毒力。QSI在治疗细菌感染方面存在较大潜力, QSI, 尤其是香茅醛这类天然低毒的QSI研究对解决抗生素耐药性问题具有重要意义。

4 结论

综上, 香茅醛通过下调QS系统关键基因、、、、、和相关毒力基因、、、、、、的表达水平, 抑制了QS系统信号分子的合成, 从而抑制了QS通路的正常生理功能, 抑制了铜绿假单胞菌PAO1菌株的生物被膜形成, 并抑制了该菌绿脓菌素和弹性蛋白酶的产生。香茅醛对PAO1有较强的QS抑制活性, 又具备植物精油的低分子量、安全性、低毒性且容易获取等特点, 而且目前尚无此化合物在QS方面的研究, 说明香茅醛在PAO1的防治及在天然QSI抗菌药物的研发方面都有重要意义。

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Quorum sensing inhibitory activity ofPAO1 by citronellal

ZENG Taohua1,2, LI Wenru2,*, XIE Xiaobao2,*, SHI Qingshan2, ZHANG Jianshe1

1. National Engineering Research Center for Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences, Guangzhou 510070, China

Various essential oils and their effective components have quorum sensing (QS) inhibitory activity. They reduced or even eliminated the pathogen's virulence and pathogenicity by targeting theirQS systems. The aim of this study is to explore the QS inhibitory activity ofPAO1 by citronellal, and to study the effects of citronellal on the virulence genes and virulence factors regulated by the QS systems. This study is of scientific significance to revealing the action mechanism of citronellal. The growth inhibition, biofilm, pyocyanin, elastase, and PQS molecules of the PAO1 straintreated by different concentrations of citronellal were determined in different time. The expression levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes in the PAO1 strain treated by citronellal were analyzed by qRT-PCR. This study found that 1.08 mg·mL-1citronellal did not inhibit the growth of PAO1 cells, but significantly down-regulated the expression of the key genes in the QS systems (,,,,,) and the related virulence genes regulated by the QS systems (,,,,,,). PQS molecules were reduced significantly with 1.08 mg·mL-1citronellal. The inhibition rate of biofilm production was 54.4% by 1.08 mg·mL-1citronellal. The yield of elastase was reduced by 84.1% and 71.6% with 2.15 mg·mL-1citronellal when PAO1 cells were cultured for 5 h and 24 h respectively. The production of pyocyanin was slightly stimulated by 0.27 mg·mL-1citronellal, and reduced by 0.54, 1.08 and 2.15 mg·mL-1citronellal. In short, citronellal had a highly effective QS inhibitory activity against PAO1. Citronellal significantly inhibited the transcription levels of the key genes in the QS systems and the related virulence genes regulated by the QS systems of the PAO1 strain. Moreover, the related virulence factors regulated by the QS systems were reduced after citronella treatment. Therefore, citronellal has potential to be developed as a QS inhibitor against.

citronellal;; quorum sensing; virulence factors; biofilm

曾桃花, 李文茹, 谢小保, 等. 香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1群体感应的抑制活性研究[J]. 生态科学, 2021, 40(4): 27–35.

ZENG Taohua, LI Wenru, XIE Xiaobao, et al. Quorum sensing inhibitory activity ofPAO1 by citronellal[J]. Ecological Science, 2021, 40(4): 27–35.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.004

Q939.92

A

1008-8873(2021)04-027-09

2020-12-06;

2021-01-15

广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515010850, 2021A1515011080)

曾桃花(1995—), 女, 江西赣州人, 硕士研究生, 主要从事微生物学研究, E-mail: 1879485675@qq.com

李文茹, 女, 博士, 研究员, 主要从事有害微生物防控研究, E-mail: liwenru@gdim.cn

谢小保, 男, 硕士, 研究员, 主要从事有害微生物防控研究, E-mail: xiaobaoxie@126.com