大鼠脑缺血再灌注模型制作流程详述及经验总结*

2021-08-19刘娅楠陶成斌张延英徐晓艳

实验动物科学 2021年3期

吴琳吴芳刘娅楠张娜陶成斌张延英徐晓艳

(1.甘肃中医药大学/甘肃省实验动物行业技术中心，兰州 730000)(2.甘肃省第二人民医院/西北民族大学附属医院，兰州 730000)(3.民勤县苏武镇羊路卫生院，武威 733300)(4.甘肃中医药大学附属医院，兰州 730000)

脑卒中是一种急性脑血管疾病，缺血性脑卒中以高发病率、高死亡率和高致残率危害人们健康。缺血性脑卒中的发病率高于出血性脑卒中，占脑卒中的60%～70%[1]，是威胁人类生命的主要疾病之一。研究脑卒中，建立脑缺血再灌注动物模型必不可少。血管内线栓闭塞法(线栓法)大脑中动脉阻塞模型，为一种理想的、目前应用最广泛的脑缺血动物模型制备方法[2]，是局灶性脑缺血的标准动物模型[3]。描述线栓法操作的详细步骤及每一步注意事项未见相关报道，为使研究者提高模型制备成功率，提供便捷的实验步骤参考，参考Longa等[4]的研究，将相关内容叙述如下。

1 实验准备

1.1 实验物品

带有固定装置的鼠用手术台、刀片(或脱毛膏、电推子)、软皂液、线剪、眼科剪(维纳斯剪)、皮镊、眼科直镊、眼科弯镊、鼠用撑开器、头端处理过的尼龙线或鱼线(根据大鼠体型选择规格，在距离头端2.0 cm处做好标记，使用前消毒处理)、动脉夹(小号)、2-0丝线、3-0丝线、圆针、三角针、持针器、小弯钳、2 mL注射器、一定浓度的麻醉剂、电子称、碘伏、脱脂棉求及照明台灯。

1.2 实验动物

大鼠具有与人类相似的解剖结构，抗感染能力强，选择变异较小的Fischer-344 大鼠或SD大鼠，实验前禁食12～24 h，避免高血糖增加梗死面积[3]。

2 操作步骤

2.1 麻醉及固定

在缺乏大鼠人工辅助通气，术中连续监测心电图、血压等实验室条件时，推荐按45 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉[3,5]。

麻醉大鼠后，大鼠翻正反射消失确定为麻醉成功，将大鼠门齿及四肢分别固定于手术台上，使大鼠呈仰卧位且颈部皮肤展平。

术者位于大鼠尾侧，本文将以阻断大鼠右侧大脑中动脉为例，为便于描述，文中方位以大鼠左侧为左，大鼠右侧为右，头侧端为上，尾侧端为下。

2.2 备皮

可用刀片或电推子备皮。由于颈部组织柔软，备皮范围四周突出骨骼的影响，很难将颈部皮肤拉紧并与突出骨在同一水平，使用刀片时容易将皮肤划坏，可以涂抹软皂液后用刀片刮毛，多次练习，达到理想的备皮效果，使备皮部位鼠毛平于皮肤表面。使用电推子备皮，不能很好去除颈部鼠毛，可能影响消毒效果等。

备皮范围，尾侧至锁骨水平，左右至两侧下颌角平行腹中线范围，头侧尽可能靠上，备皮范围呈上窄下宽的梯形。将刮下的鼠毛置于水中，避免毛到处乱飞，清理干净颈部掉落的鼠毛，避免进入手术视野，影响操作、手术效果及预后。

2.3 消毒

用蘸有碘伏的棉签或止血钳夹持的棉球消毒，消毒范围至备皮边缘外侧约0.5 cm。由于实验于SPF设施进行，同时便于术中观察大鼠呼吸及皮肤色泽，不建议铺洞巾，但应设置专门放置手术器械的容器，减少手术器械的污染，每做完一只鼠后器械消毒，减少大鼠术中感染概率。

2.4 手术切口的选择

于前正中线，以胸骨水平向上约0.5 cm处起，至下颌角水平上0.5 cm，长约2.5 cm，以刚能放进鼠用撑开器为宜。皮镊夹住胸骨上0.5 cm处皮肤，沿前正中线方向用线剪剪一小口，后用皮镊将此切口下端夹持牵拉向下，用线剪挑起开口头侧端，沿切口向上剪开皮肤，以减少皮下组织损伤，且开口边缘整齐，在一条直线上，美观且便于缝合。

2.5 分离血管

2.5.1分离目标血管前准备：为避免出血较多，钝性分离浅筋膜，即于前正中线沿切口方向撕开，两侧较大的球形腺体表面浅筋膜尽量完好，以免暴露腺体遮挡手术视野。沿前正中线气管表面，用镊子或止血钳钝性分离气管表面的肌肉(胸舌骨肌)，上至胸舌骨肌止点，向下与切口对齐。提起胸舌骨肌右侧半头侧部分，分别沿两侧胸舌骨肌内侧面向下钝性分离。由于只分离手术侧，放置撑开器后会牵拉气管，致使气管偏向对侧，影响大鼠呼吸，遂将两侧颈前肌均依照前法分离。若从下向上分离胸舌骨肌，易将止于甲状软骨并斜形覆盖于颈总动脉表面呈束状的肌肉游离，影响手术视野。操作过程中应注意动作轻柔，避免拉断肌纤维，造成不必要的损伤。分离前明确所有目标血管位置(图1)。

图1 大鼠头颈部血管示意图[1]

2.5.2放置撑开器：避免将颈总动脉(CCA)表面斜形走向止于甲状软骨的肌肉置于撑开器下面，否则会遮挡视线，影响后续操作，甚至拉断此肌纤维束。

2.5.3分离颈总动脉：于CCA靠内侧边缘用眼科弯镊逐层分离颈动脉鞘，便于游离CCA，同时减少刺激与其伴行的迷走神经及交感神经，约齐平第5气管软骨环，CCA表面有颈总静脉一属支，避免损伤，可于其上，即靠头侧分离CCA，用2-0或0号丝线横穿CCA，不打结，止血钳夹闭丝线两端用于牵引，必要时可牵拉此牵引线进行紧急止血。

2.5.4分离颈外动脉前处理：约平行于甲状软骨下缘处CCA分为颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA分叉之前，分叉下0.1～0.3 cm处有一神经盘旋呈“C”形跨于CCA表面，可将其用眼科镊分离、牵拉至气管侧，不影响后续分离及操作。牵拉颈总动脉牵引线，继续向上可分离CCA分叉及ECA、ICA，先于靠近胸舌骨肌内侧壁，将此肌肉与血管分叉、ECA、ICA及血管外包被的组织分离开，动作轻柔，可无渗血，若有渗血，以大小适中脱脂棉球压迫止血。分离于胸舌骨肌止点水平时尤其注意动作轻柔，若过于粗暴，会引起较多渗血，且不易快速止血，若有渗血可脱脂棉球压迫止血。由于棉球压迫面积及受力点可以随意调节，同时压迫的面积相对较大，建议以小棉球止血。

距ECA与ICA分叉约0.4 cm处，ECA第二支分支即甲状腺上动脉，在放置撑开器并未进行分离状态下，此血管先向背离地面方向走行，向外侧方走行，小心分离并结扎甲状腺上动脉(条件允许，可用电凝笔离断，很大程度提高工作效率)，避免连接于ECA的盲端过长。如此可避免损伤此动脉，从而避免大量出血。若不结扎此动脉，后续操作很容易将此动脉牵拉致出血，以致止血无效，同时鱼线不能以直线路径插入大脑中动脉。值得注意的是，实验过程中发现，一部分甲状腺上动脉于颈总动脉发出，可先行将其结扎。

2.5.5分离颈外动脉：离断甲状腺上动脉后，便于继续分离干净ECA周围的组织，使ECA游离出长0.6～0.7 cm。可于分离一段长度后，以4-0丝线结扎ECA时边结扎边分离，即先于距离CCA分叉约0.5 cm处进行一次结扎；轻轻牵拉此结扎线继续分离ECA，在ECA远心端留有离断后线结不会脱落长度的位置进行第二次结扎。注意打紧线结，避免线结脱落，同时注意适度用力，避免将ECA于打结时暴力拉断。若被覆于ECA周围筋膜等不分离干净，后续ECA结扎线易于滑脱，影响“V”形切口制作，同时不便观察“V”形切口位置，影响后期鱼线插入。

轻轻牵引近心端线结，于两线结间剪断ECA，使ECA留有0.4～0.5 cm盲端。留近心端线结尾线，减少牵拉此尾线次数。剪去头侧端线结尾线，可避免后期操作时将此线结撕脱，例如，在放置或取下ICA动脉夹时因尾线过长，被夹于动脉夹中致线结撕脱。即使撕脱当时未见出血，但留有隐患，不便发现死亡原因，一般会在造模结束后因出血过多以及血块压迫气管窒息而亡。3-0或2-0丝线由于线结较大，占用较长血管，使ECA盲端较短，且线结易滑脱。

2.5.6分离颈内动脉：分离ICA时注意避免损伤ECA第一个分支枕动脉，距离分叉0.1 cm，直径约0.05 cm，并与ICA 伴行。为避免之后鱼线误入此动脉，可先将其离断，若操作熟练，可不处理。钝性分离ICA周围组织，尽量避免刺激、离断ICA周围神经。确定CCA分叉与动脉夹间距离≥0.2 cm，便于确定鱼线插入位置。若保证动脉夹可稳定夹闭ICA，可不必将其周围组织剃除干净；操作不熟练，建议分离干净其周围组织，完全暴露ICA，但致使损伤增加。

2.6 插入鱼线及鱼线的固定

首先将CCA近心端(于横跨CCA的颈总静脉属支下方)及ICA远心端用大小合适的动脉夹夹闭，放松牵引线，使两动脉夹之间的盲管没有张力。此时于ECA近心端放置一根4-0丝线待用，提起ECA盲端，建议提起结扎线尾线的其中一根，用眼科剪于盲端靠近线结0.1 cm处做一“V”形切口，夹取带有刻度的鱼线，使其与ECA成45°夹角，缓缓插入至ICA，并于ECA根部4-0丝线打结一次(非方结或死结，方结即打结两次)初步固定栓，确保松开ICA上动脉夹不会引起出血，但可轻松活动鱼线。

“V”形切口形成后，尽量不要松开ECA牵引线，便于观察切口位置；切口处出血可作为切口位置的标志；不要蘸去“V”形切口处血液，可避免挤压致血管塌陷；若两动脉夹间张力过大、盲管内血液被挤出，或不便找到“V”形切口位置，可镊子夹闭CCA近心端，将CCA上的动脉夹松开，可有少量血液充盈盲管，便于重新找到“V”形切口。单人操作时，鱼线插入后，可先止血钳轻轻牵拉ECA盲端结扎线(注意向尾侧牵拉，使鱼线稳定于ICA内，此时鱼线未固定)，再于ECA根部结扎线打结一次；若有助手，可一人牵引盲端结扎线并固定鱼线，一人打结。

取下ICA上动脉夹，牵拉CCA牵引线，使ICA与前正中线成约45°，鱼线与前正中线成35°～40°，并尽可能与地面成0～15°，避免将线打弯，可拇指在上，余四指在下持镊夹持鱼线，缓缓插入大脑中动脉(MCA)，进入超过1.0 cm时，即确定鱼线头端越过翼腭动脉起始处时，轻轻松开CCA牵引线，继续缓缓向头端插入，稍遇阻力立即停止前进，此时，鱼线进入1.8～2.0 cm，鱼线上的标记刚好于CCA分叉处。再次打结，完成ECA根部固定线的方结，以鱼线可于血管内活动、松开CCA上动脉夹不出血为准。

鱼线越过翼腭动脉后松开CCA牵引线，可避免鱼线进入过多；同时由于ICA弹性回缩，可能带动鱼线扎破MCA，导致蛛网膜下腔出血，使大鼠于术后72 h内死亡。若未能一次进入，略微调整角度回抽一部分鱼线重新插入。若用力过大，会使鱼线弯曲，影响后续再次尝试插入。

2.7 术部处理

2.7.1检查术野：松开CCA上动脉夹但先不拿去，查看ECA盲端有无出血，确定无出血则完全去掉动脉夹；若有出血，重新结扎ECA根部结扎线。确保手术视野无渗血。

2.7.2缝合：拿去撑开器，碘伏或酒精棉球消毒皮肤，2-0或0号丝线连续全层缝合，避免留有死腔。打结要紧，避免线头太长，因为大鼠会用爪子挠，有时可撕破皮肤。

2.7.3术后处理：松开四肢及头端固定线，将大鼠分笼安置于温暖环境，注意保温。注意垃圾分类处理。

2.8 再灌注

于鱼线插入后90 min进行再灌注。此时，用手将大鼠颈部皮毛固定，由于大鼠术后疼痛，再灌注使挣扎明显，必要时再次进行麻醉，将露在皮外的鱼线向外退0.5～1 cm，并剪短，以避免大鼠活动等将鱼线回插，扎破血管造成再次损伤。再灌注过程中避免将全部鱼线退出，即使再灌注后未见明显渗血，24 h内也会造成颈部出血过多或压迫气管导致窒息使模型制作失败。