SD大鼠凝血四项检查正常参考值范围探讨*

刘珍清 赵媛媛 任一冉 张美龄 刘 颖

(1.北京中医药大学北京中医药研究院，北京 100029)(2. 北京中医药大学中药学院，北京 102488)

止血、抗凝等药物的药效评估以及新药的安全性评价一般需要对凝血四项参数：凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)进行检测，从而进一步监测止血和抗凝等药物的疗效、其可能作用的凝血通路以及新药潜在的毒性反应等[1-2]。因此，凝血四项指标的可靠性与准确性将会对最终的实验结果产生直接的影响。实验室检查中对PT、APTT、TT和FIB的检测实际上是监测一系列酶促反应终点的过程，故从取材到最终指标检测的整个过程中，大鼠的取血方式、血样是否溶血、标本量、抗凝剂的品牌等众多的因素皆会对实验结果产生干扰[3-5]。目前，尚未见有关SD大鼠凝血四项检查正常参考值范围的报道。因此，建立本实验室凝血四项检查参考值范围，对规范基础药理学研究和新药研究具有十分重要的意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，雄性，体质量(190±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠在同一环境下适应性饲养3 d，温度23～25 ℃，相对湿度55%～65%，实验动物自由进食饮水，12 h/12 h明暗饲养。实验开始前，动物禁食不禁水12 h。伦理审查编号：BUCM-4-2019041802-2090。

1.2 实验仪器

Sysmex CA-550型全自动凝血分析仪(日本希森美康公司)；HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

1.3 实验试剂

质控液、定标液和凝血四项检测试剂盒均购自希森美康生物科技(无锡)有限公司。凝血酶原时间测定试剂(凝固法)，批号：R8038；活化部分凝血活酶测定试剂(凝固法)，批号：R8034；凝血酶时间测定试剂(凝固法)，批号：48123；纤维蛋白原测定试剂(凝固法)，批号：R8043；缓冲液，批号：R6009；氯化钙溶液，批号：R6010；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，批号：20180523；3.2%枸橼酸钠抗凝剂(上海源叶生物科技有限公司)；氯化钠注射液(石家庄四药有限公司)。

1.4 实验方法

40只SD大鼠标号称质量后，以水合氯醛(40 mg/kg)将大鼠麻醉后，于腹主动脉取血，并按照9∶1的比例与3.2%枸橼酸钠抗凝剂混合均匀，以3 000 r/min离心15 min，取出上层血浆，利用全自动凝血分析仪检测PT、APTT、TT和FIB四项指标，检测需要在2 h之内完成。

1.5 数据分析

2 结果

SD大鼠凝血四项的检测结果见表1所列。

表1 SD大鼠PT、APTT、TT和FIB测定结果

3 讨论

凝血四项检查不但是临床用于凝血功能初筛的参数，同时也是实验室中止血和凝血等相关药物研究和安全性评价的重要指标[5]。随着分子生物学、免疫学等学科的快速发展，凝血四项检查已经不单单应用于出血或者凝血等疾病的诊断范畴，对肝炎、肝硬化、妊娠高血压等多种疾病的诊断也具有很大的临床价值[6-9]。凝血四项参数中的PT既可以反映机体的外源性凝血通路，包括凝血因子Ⅶ、Ⅹ、Ⅰ和Ⅱ的含量及其活性，也可以用来监测弥漫性血管内凝血和肝脏蛋白质合成成功与否。本研究采用凝固法，通过向待测血浆中加入氯化钙和组织因子来观察其凝固需要的时间从而获取SD大鼠的正常PT值范围。APTT可以初步反映机体的内源性凝血通路和筛查凝血因子(Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)是否缺乏，还可用于狼疮抗凝物、监测肝素抗凝治疗等的监测[10]，是当前抗凝药物检查的重要指标。TT既是低(或无)FIB血症以及异常纤维蛋白血症等FIB减少的指标，同时也可以用于衡量纤维蛋白(原)降解产物是否增高。临床上多用于肝素治疗检测，也用于活血化瘀药物、止血药物[11-12]等药效的检测。另外，FIB作为肝脏合成的凝血因子，是血凝块能够稳定形成的重要结构组成，在血浆中的含量最高[13]。在机体大量出血时，FIB最先消耗并最早达到凝血因子的临界值，由此可见该指标在探讨药物止血或者凝血作用的重要性。

SD大鼠具有稳定性较好、价格便宜等优点，是目前研究止血或凝血药物对凝血四项影响的常用实验动物。谢珍等[14]对不同采血方式对SD大鼠的凝血四项参数指标影响进行了考察，结果显示腹主动脉采血得到的血样的PT、APTT、TT及FIB指标的稳定性好，动物之间数据没有统计学差异。何佩恒等[15]研究不同取血方式对Wistar大鼠的血液学指标的影响，从而得出腹主动脉取血所获取的血样的各项血常规指标之间无统计学差异。另外，利用真空管和采血针对SD大鼠腹主动脉取血速度快，且在采血过程中受到的干扰因素少，样品的成分以及性质较为稳定，因此本研究中所检测的血样皆通过腹主动脉取血获得。除此之外，已有文献研究EDTA-K2抗凝剂中的EDTA可以干扰或者抑制纤维蛋白凝块形成时的纤维蛋白单体的聚合；草酸钠抗凝剂可以与血中的Ca2+生成不溶性的草酸钙沉淀，与这两种抗凝剂相比，枸橼酸钠抗凝剂因其具有保护凝血因子等优势成为检测凝血四项的理想抗凝剂。在本研究中，参照文献中常用的抗凝浓度，利用3.2%枸橼酸钠抗凝剂作为SD大鼠的抗凝剂。

综上，在血液样本的PT、APTT、FIB和TT的检测过程中，血浆存放的时间、抗凝剂的种类、取血方式、血液质量以及分析系统[16]等因素均会影响凝血四项的检测值。因此，本实验室在固定样本前处理方法的情况下，建立了本室的正常SD大鼠的凝血四项参考值范围，其结果与文献记录一致[17-19]。该范围的建立加强了实验室检查和管理的质量控制，并为后续药理实验的顺利开展提供了参考。