一株诱导粘细菌子实体形成的被捕食菌的筛选及分子鉴定

原红娟, 朱红惠

一株诱导粘细菌子实体形成的被捕食菌的筛选及分子鉴定

原红娟1,2, 朱红惠2,*

1 运城学院生命科学系, 山西运城 044000 2 广东省微生物研究所, 省部共建华南应用微生物国家重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室、广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070

为筛选适宜于诱导粘细菌子实体形成的被捕食菌, 利用诱导分离的方法, 从酵母菌、革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌共30株菌中进行筛选, 利用扫描电镜观察形态特征, 通过16S rRNA确定系统分类地位, 并对其分离培养基进行优化。获得一株被捕食菌GIM1.767, 经透射电子显微镜观察长约为1.2—1.24 μm, 宽度约为0.6—0.65 μm, 无鞭毛, 分子鉴定为s; 对分离培养基进行优化, 发现添加1% 酵母粉的WCX培养基, 对粘球菌属能更好的分离诱导。分离得到菌株, 对挖掘粘细菌资源提供一些参考价值。

被捕食菌; 分离纯化; 粘细菌

0 前言

粘细菌(myxobacteria)是一类可以通过分泌粘液来执行滑行运动的革兰氏阴性杆菌, 能够产生丰富的结构新、种类多及作用机理新颖的活性物质, 是继放线菌之后的又一重要药源微生物新类群[1–2], 具有重要的潜在开发应用前景[3]。

粘细菌在环境中广泛存在, 并在一定的条件下形成肉眼可见的子实体[4-6]。在低营养的培养基上, 能够形成粘液丰富的、薄而扩展的菌落[7-9], 由其分泌的胞外粘液使子实体不易分散, 粘细菌生长具有密度依赖性, 单细胞不易萌发生长[10]且容易被污染; 在营养丰富的培养基上, 粘细菌不形成子实体只形成不扩散的菌落, 造成粘细菌不能与其他细菌分开[11-12]。除此之外, 粘细菌生长缓慢, 易被其他生长迅速的菌覆盖或污染[13]。粘细菌的这些特性使得在分离纯化粘细菌过程中存在许多问题, 也是制约一些研究者对其研究的主要原因。

粘细菌作为微生物中的捕食菌(Micropredators), 可以捕食和裂解其他活的或死的微生物[14-15], 主要通过粘细菌产生的胞外活性物质如细胞裂解酶、抗生素、核酸酶、酯酶、蛋白酶和多糖酶裂解其他微生物细胞, 作为小分子物质来满足自身的营养需求。根据其食性粘细菌分为两大类群, 分别为溶细菌类群(Bacteriolytic group)和溶纤维素类群(Cellulolytic group)。粘细菌除捕食细菌外, 还可以真菌, 如酵母菌、真菌和绿藻。因其细胞结构与组分的不同, 使粘细菌对被捕食菌裂解的难易及嗜好不同。

热带森林土壤和腐烂的树木是分离粘细菌, 发现新的粘细菌资源最好的来源[16]。而越南是典型的热带地区, 有丰富的热带原始森林, 因此, 从热带原始森林腐木或土壤中分离粘细菌, 极有可能发掘到大量的粘细菌新资源, 得到功能新颖、遗传背景多样、且有重要利用价值的粘细菌资源, 从而为发现粘细菌新的活性物质和新的功能提供物质基础。

本研究针对样品的特性, 利用越南的土样筛选出诱导效果较好的被捕食菌, 并对其进行分子鉴定。依据诱导过程中存在的问题[17-19], 以及不同类群的粘细菌食性不同, 筛选的被捕食菌结合改良诱导培养基, 使样品中的粘细菌更易诱导分离。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

酵母菌:GIM2.6、GIM2.9、GIM 2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM2.132、GIM2.134、GIM2.149、GIM2.159、GIM2.173。

革兰氏阴性菌:GIM1.223、GIM1.236、GIM1.224、GIM1.279、GIM1.767、GIM1.323、GIM1.205、GIM1.265、GIM1.331、GIM1.379、GIM1.767。

革兰氏阳性菌:GIM 1.221、GIM1.276、GIM1.143、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058、GIMT1.044、GIMT 1.249、XJ1、XJ15。

以上菌种均由广东省微生物菌种保和藏中心提供, GIM1.767、XJ1、XJ15为本实验室在新疆盐碱地土壤中筛选的被捕食菌。

1.1.2 主要培养基

① CY培养基、NA培养基、MRS培养基、VY/2培养基、水琼脂培养基(WCX)[20]

② R2A合成培养基

改良WCX培养基: CaCl2·2H2O 0.1%, 酿酒酵母1%, 琼脂1.5%, pH 7.2。

改良WCX培养基: CaCl2·2H2O 0.1%, 胰蛋白胨0.3%, 琼脂1.5%, pH 7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理

用加放线菌酮(终浓度100 μg·mL–1)的无菌水浸泡土样过夜, 用3K30C 型冷冻离心机(德国SIGMA公司)离心5 min(8000 r·min–1), 弃上清。

1.2.2 分离粘细菌

①将革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌接种于NA液体培养中, 37 ℃ 振荡培养24 h, 酵母菌接种于MRS液体培养基中, 28 ℃ 振荡培养24 h。

②将30种菌液各取100 uL, 涂布于CY平板上, 过夜培养, 将处理好的土样, 接入长满菌的CY平板上, 30℃下诱导培养, 每个处理重复三次。

③3天后置于在LEICA001型体式镜(德国LEIKA公司)下观察, 并挑取子实体于VY/2培养基上纯化。

1.2.3 透射电镜(transmission electricity microscope, TEM)观察[20-21]

1.2.4 促进粘细菌子实体形成效果评价

取对数生长期的被捕食菌液100 uL, 涂布于新鲜的CY培养基上, 每个样品三个重复, 1h 晾干后, 将粘细菌用针头接种至CY培养基上, 三天后观察拍照, 评价子实体形成效果。

1.2.5 DNA的提取

采用改良CTAB法[22]提取纯培养物DNA。

1.2.6 PCR扩增

16S rRNA扩增使用细菌通用引物[23-24], 引物由广州英俊测序公司合成。

1.2.7 系统发育分析

将菌株16S rRNA基因序列利用BLAST搜索软件在GenBank数据库中进行相似性搜索, 使用CLUSTAL.X[25]软件进行序列比对, 采用Neighbor- joining[26]构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 被捕食菌的初步筛选

利用革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌各10种菌株(见1.1.1), 初步对越南三个土壤样品进行诱导研究, 由表1可知: ①从总体诱导效果上看革兰氏阴性菌诱导效果最好, 其次酵母菌, 革兰氏阳性菌诱导效果最差; ②革兰氏阳性菌能分离得到的粘细菌, 酵母菌和革兰氏阴性菌均能分离得到, 即革兰氏阳性菌分离得到的粘细菌种属较少, 只有和两个属, 且主要为。③分离粘细菌颜色都较鲜亮, 但由于酵母菌在解剖镜下颜色无色透亮, 因此分离一些颜色较浅的粘细菌比较困难, 或者会容易漏看(如图1 I), 且多数酵母菌诱导时, 如GIM2.6、GIM2.34、GIM2.84、GIM2.127、GIM 2.132、GIM2.149和GIM2.173, 培养基上易出现白色且硬的片状物质(见表1), 对纯化过程造成一定的影响(如图1 C)。④霉菌污染严重(如图1 E、F、H), 特别是革兰氏阳性菌,GIM1.276、GIM1.247、GIMT1.083、GIMT1.058和XJ15, 在4-5天就被霉菌覆盖, 这可能与菌体自身的代谢有关。⑤由表1被捕食菌诱导效果可知, 土壤中易诱导的在本样品中通过常规培养(CY培养基)不易诱导出, 且多数在2周左右才诱导出, 对之后的纯化工作带来很大的困难。

综合以上结果, 在30株诱导菌中, 优先选择革兰氏阴性菌, 而革兰氏阴性菌中, 诱导效果最好的菌株为GIM1.767(见表1)。

2.2 被捕食菌的形态观察

利用日立H-7650型透射电子显微镜, 利用对被捕食菌GIM1.767的形态进行了观察, 结果如图2所示, 长度约为1.2—1.24 μm, 宽度约为0.6—0.65μm, 无鞭毛。

注: A.E. coli GIM1.223; B. Staphylococcus sciuri GIMT1.249; C.Saccharomyces cerevisiae GIM2.132; D. Erwinia persicina GIM1.331; E. Klebsiella pneumonia GIM1.279; F. Candida utilis GIM2.9; G.Saccharomyces cerevisiae GIM2.127; H.Serratia marcescens GIM1.323; I.Debaryomyces hansenii GIM2.149)。

Figure 1 Rendering of three types of some prey bacteria induce fruiting body

表1 被捕食菌的诱导效果

2.3 被捕食菌生长曲线的测定

被捕食菌的诱导效果, 通常利用对数生长期的菌体进行涂布或划线诱导。由图3(A图) 菌株GIM1.767的生长曲线可知, 菌株GIM1.767在2.0 h进入对数生长期, 生长1.5 h后达到稳定生长期。而的对数生长期较长(图3 B图), 从2 h开始对数生长期, 至7 h达到稳定生长期, 即的的对数生长期大约5小时, 较菌株GIM1.767的对数生长期长近3.5h。

2.4 菌株GIM1.767的分子鉴定

将被捕食菌GIM1.767的16S rRNA基因的序列利用BLAST搜索软件在GenBank数据库中进行相似性搜索, 并调取相关种属的相近模式菌的16S rRNA序列, 以ATCC 25416T为外类群构建系统发育树, 结果显示, 被捕食菌GIM1.767与菌株S1Y1- bLLT、NG-R17T和DPN7T的相似性均达99%。使用CLUSTAL.X(Thompson., 1997)软件进行序列比对, 利用MEGA4.0的Neighbor-joining构建系统发育树(见图4), 系统发育分析显示, 菌株GIM1.767与的进化距离较近, 应归类于。

图2 被捕食菌GIM1.767透射电镜形态图(0.5 μm)

Figure 2 Transmission electricity microscope observation of predation GIM1.767

注: A. GIM1.767的生长曲线; B. E. coli的生长曲线。

Figure 3 Growth curve of prey bacteria

注: 标尺代表进化树的进化距离, 括号中的内容代表菌株的登录号, Burkholderia cepacia ATCC 25416T作为外类群

Figure 4 Molecular identification of strain GIM1.767 based on 16S rRNA gene sequence

2.5 菌株GIM1.767诱导粘细菌子实体形成的培养基的优化

分离越南土壤样品的过程中, 发现土壤中易分离的粘球菌属不易诱导, 或在10至14天才被诱导出, 但此时因霉菌污染使其不易纯化, 因此, 设计了两种优化培养基, 以基础的WCX分离培养基为对照, 分别在WCX培养基中添加适量的酵母提取物(1%)、胰蛋白胨(0.3%)及R2A培养基作为分离培养基, 利用诱导菌GIM1.767进行划十字线分离粘细菌。由表2、图5可知, 添加胰蛋白胨的分离培养基诱导不出或能诱导出极少数的粘细菌, 且形成的子实体不明显或无子实体形态。其余三种分离培养基, 诱导出的粘细菌种类和颜色差异不大, 但诱导粘球菌属在时间上有差异, WCX需12—14天, R2A培养基10—12天, WCX添加酵母提取物的培养基诱导时间最短, 需5—7天。诱导的粘细菌子实体大小上, WCX与添加酵母提取物的WCX无明显差异, 但R2A诱导的粘细菌子实体较小。

表2 几种诱导粘细菌子实体形成的培养基

注: A. WCX培养基上诱导的M. Xanthus; B. 添加1%酵母提取物的WCX培养基上诱导的M. Xanthus; C. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培养基上诱导的M. Virescens; D. R2培养基上诱导的M. Xanthus; E. 添加1%酵母提取物的WCX培养基上诱导的C. Coralloides; F. 添加0.3%胰蛋白胨的WCX培养基上诱导的C.coralloides; G. WCX培养基上诱导的Cystobacer; H. 添加1%酵母提取物的WCX培养基上诱导的Cystobacer; I. R2培养基上诱导的Cystobacer。

Figure 5 Rendering of three types of some prey bacteria GIM1.767 induce fruiting body (day 8)

以上结果显示, 分离越南土壤样品最适宜的培养基为WCX添加酵母提取物的培养基。

3 讨论

粘细菌的研究自1809年至今已经历了200多年, 由于分离纯化技术的限制, 目前已经描述的粘细菌只有7个科, 24属, 56个种[27-29]。分离技术限制的原因之一就是被捕食菌, 一般分离粘细菌通常选用易捕食的革兰氏阴性大肠杆菌[30], 但被捕食菌也可以选取酵母菌或革兰氏阳性菌。粘细菌作为微生物群体中的捕食者, 由于其偏好性或捕食机理的差异, 相同环境下粘细菌捕食的对象可能不同。李百元等[31]在利用被捕食细菌诱导分离新疆盐碱地粘细菌中发现, 在相同的培养环境下,只捕食了革兰氏阳性菌。本研究利用被捕食菌捕食的偏好性不同, 选取30种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌对越南三个样品进行诱导研究, 结果发现革兰氏阴性菌诱导效果最好, 子实体明显, 颜色鲜艳, 诱导的种类较多, 且不会产生白色片状物质; 并结合各种诱导因素(见表1)选取了一株革兰氏阴性菌GIM1.767作为最佳的被捕食菌; 通过透射电子显微镜观察发现, 被捕食菌GIM1.767的形态为无鞭毛, 长度约为1.2—1.24 μm, 宽度约为0.6—0.65 μm。菌株GIM1.767的对数生长期在2.5—4 h。在CY培养基上, 被捕食菌促进粘细菌子实体形成效果显示, 菌株GIM1.767比诱导的子实体形成的时间提早2天左右, 为后期分离纯化粘细菌不易被霉菌污染提供了有利的时间保障, 通过16S rRNA基因的分子鉴定, 菌株GIM1.767属于。

土壤微生物是土壤生态系统中最为重要的部分, 是土壤分解系统中的主要成分, 而捕食菌通过捕食其他微生物, 来控制土壤微生物的数量, 从而影响微生物的群体结构[32-34]。通过16S rRNA基因的分子鉴定, 菌株GIM1.767属于, 经培养基的优化, 其分离粘细菌最佳培养基为WCX添加1%的酵母提取物的培养基。

通过本实验筛选得到菌株GIM1.767, 说明不同生境的粘细菌对被捕食菌的偏好性不同, 其原因可能与被捕食产生的气体、代谢产物及其滑行机制有关[35], 需进一步研究, 其研究结果为分离纯化粘细菌提供一些应用参考价值。

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Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies

YUAN Hongjuan1,2, ZHU Honghui2,*

1 Department of Life Science, Yuncheng University, Shanxi 044000, China 2 Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology. Guangzhou 510070, China

In order to screen the predatory bacteria suitable for inducing the formation of myxobacteria fruiting bodies, the induced separation method was performed to select 30 stains from microbes including yeasts, Gram negative and Gram positive bacteria. Subsequently, the morphological characteristics were observed by scanning electron microscope and phylogentic position was analyzed based on 16S rRNA. In addition, the isolation medium was optimized. One prey bacterium GIM1.767 was identified as. According to scanning electron microscope, its length and width were 1.2-1.24 μm and 0.6-0.65 μm, respectively, without flagella. Optimization of isolation medium found that the WCX medium with 1% yeast extract was effective to separate thestrains. Isolation of strainhad certain reference application value to excavate myxobacteria resources..

preybaceria; islation purification; myxobacteria

原红娟, 朱红惠. 一株诱导粘细菌子实体形成的被捕食菌的筛选及分子鉴定[J]. 生态科学, 2021, 40(4): 113–120.

YUAN Hongjuan, ZHU Honghui. Screening and molecular identification of a predator inducing the formation of myxobacterial fruiting bodies[J]. Ecological Science, 2021, 40(4): 113–120.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.04.013

Q936.2

A

1008-8873(2021)04-113-08

2020-02-07;

2020-05-18

山西省面上青年基金项目(No. 201601D202061); 广东省国际合作项目(No.2012B050700009); 运城学院博士科研启动项目(No.YQ-2017009);山西省重点学科建设经费资助(No.FSKSC)

原红娟(1978—), 女, 山西运城, 博士, 副教授, 主要从微生物资源开发研究, E-mail:yhj1793@163.com

朱红慧, 女, 博士, 主要从事微生物研究, E-mail: zhuhh@gdim.cn