降脂瘦身汤对非酒精性脂肪肝大鼠脂代谢及核转录因子-κB蛋白表达影响的实验研究

董文娟，杨立宏，张文佳

(新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830054)

随着人们物质生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)逐步发展为最常见的慢性肝病，且发病率日益升高[1]。更引起人们重视的是，NAFLD是许多代谢性疾病的危险因素，包括肥胖、2型糖尿病[2]及心血管疾病等，可进展为脂肪性肝炎、肝纤维化、肝癌，严重威胁着人们的身体健康[3]。许多学者认为脂肪组织核转录因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)可调控多种脂肪因子和炎症因子在脂肪细胞中的表达，参与脂肪代谢等过程[4-5]。目前中药制剂治疗非酒精性脂肪肝病已在临床中取得一定疗效，本研究旨在观察降脂瘦身汤对非酒精性脂肪肝病大鼠脂代谢的干预效应及对脂肪组织NF-κB蛋白表达的影响，为临床使用降脂瘦身汤治疗NAFLD提供新的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD级大鼠，共32只，采购于新疆医科大学动物中心，体重(210±10) g,合格证号：SCXK(新)2018-0003。

1.1.2 主要试剂：血糖含量试剂盒，购自索莱宝公司；游离脂肪酸测试盒、伊红染液(水溶性)、苏木素染色液、TG试剂盒及T-CHO试剂盒均购自南京建成公司；大鼠胰岛素(INS)ELISA Kit购自武汉华美。Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit (BCA)，全式金公司，批号：DQ111-01；蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂公司，批号：AR1178；蛋白预染Marker，上海生工公司，批号：C610013；NF-κB-p65(D14E12) XP®Rabbit mAb，CST公司，批号：8242T；Phospho-NF-κB-p65(Ser536)(93H1) Rabbit mAb，CST公司，批号：3033T。

1.1.3 实验仪器：台式离心机(上海力申科学仪器制造厂)，型号：Neofuge；漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，型号：GL-88B；酶标仪(Bio-Rad,China)，型号：xMarkTM；移液器(Eppendorf,Germany)，型号：Dragon lab；化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司)，型号：Chemiscope 3000；蛋白转膜仪(Bio-Rad,USA)，型号：Mini-PROTEAN Tetra system；电泳仪(Beijing Liuyi,China)，型号：DYCZ-24DN；脱色摇床(江苏其林贝尔)，型号：TS-3D，等。

1.2 实验方法

1.2.1 实验药品：降脂瘦身汤组成为，生黄芪、党参各30 g，半夏、红花各9 g，泽泻12 g，陈皮、炒桃仁、山楂、荷叶、决明子各15 g，丹参20 g等。以上中药饮片由三九药业生产提供；动物高脂饲料由新疆医科大学医学实验动物中心提供。

1.2.2 造模及分组：SD大鼠32只适应性喂养1周后，随机取11只为正常组，予普通饲料喂养；余造模组21只，予高脂饲料喂养，各组大鼠均自由饮水。饲养8周后，分别从正常组、模型组中随机抽取1只大鼠取肝脏做病理切片，证实造模成功，以《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》的诊断为标准。造模成功后，将造模组20只大鼠随机分为降脂瘦身汤组及模型组，每组10只。

1.2.3 干预方法：正常组及模型组均给予等量0.9 %氯化钠溶液灌胃，中药降脂瘦身汤组根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》计算，每100 g大鼠每天中药用量为0.108 g，每天下午1次，连续灌服4周。4周后处死，处死前夜禁食禁水12 h。

1.3 观察指标

1.3.1 体重、肝湿重及肝指数：实验期间每周对大鼠进行称重，记录体重，实验结束后，摘取大鼠肝脏称重，肝指数=肝湿重/体重×100%。

1.3.2 生化指标：腹主动脉取血，按照血糖、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸等生化指标试剂盒操作方法进行测定。

1.3.3 观察大鼠肝脏组织病理情况：在肝脏左叶相同部位取肝组织进行梯度脱水，将脱水处理过的组织用石蜡进行包埋，最后切成5 μm厚的薄片，放在温水浴中进行展片，将展匀称的组织固定于载玻片上，做成石蜡切片。镜下观察肝脏组织形态学改变。

1.3.4 检测NF-κB-p-p65、NF-κB-p65的表达：取各组的肝脏脂肪组织，按Western blot实验报告中实验步骤进行操作，检测其中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白的表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用方差分析或非参数检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 整个实验过程中各组动物饮食饮水正常，皮肤完整无溃烂，皮毛干净有光泽；大便成形，未发现有稀便；小便不浑浊，颜色正常。动物精神活跃、抓捕抵抗强烈。在药物干预开始后，降脂瘦身汤组死亡1只大鼠。经观察，死亡动物体表有撕咬、打斗的伤口。经解剖，死亡动物脏器均未发现异常。故而判断，可能是由于动物体型偏大为争抢活动空间而进行打斗，从而导致死亡。调整饲养密度，并将好斗的动物隔离后再无动物死亡。

2.2 各组大鼠体重、肝湿重及肝指数比较 见表1。与正常组相比，模型组大鼠体重、肝湿重、肝指数增加(均P<0.01)；与模型组相比，降脂瘦身汤组大鼠体重、肝湿重、肝指数下降(均P<0.01)。

表1 各组大鼠体重、肝湿重及肝指数比较

2.3 各组大鼠血清生化指标比较 见表2。模型组血清中的Glu、FFA、TG、TC、INS含量与正常组相比显著升高(均P<0.05)；降脂瘦身汤组血清中的Glu、FFA、TG、TC、INS含量与模型组相比显著降低(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血清生化指标比较

2.4 各组大鼠肝脏组织HE染色结果 实验结束后，取肝脏组织样本进行HE染色后，在显微镜下观察发现：模型组大鼠的肝脏脂肪变性较为明显，占全视野的80%以上，肝脏细胞变大变圆，部分肝脏细胞内可见巨大的脂肪滴，部分肝脏细胞内可见炎性细胞浸润；降脂瘦身汤组同样有肝脏细胞的脂肪变性，但与模型组比较明显减轻，少见脂肪滴及炎性细胞的浸润(图1)。

图1 各组大鼠肝脏病理组织学比较(HE染色，×400)

2.5 各组大鼠脂肪组织中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表达比较 见表3(图2)。免疫印迹法测定显示：与正常组相比，模型组的NF-κB-p-p65表达水平显著升高；与模型组相比，降脂瘦身汤组的NF-κB-p-p65表达水平显著降低(均P<0.05)。

表3 各组大鼠脂肪组织中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表达比较

图2 各组大鼠脂肪组织中NF-κB-p-p65、NF-κB-p65蛋白表达

3 讨 论

NAFLD是指除酒精和其他明确的肝脏损害因素导致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，发病机制尚不清楚，但许多学者认为其发病机制主要是各种原因导致的脂质代谢紊乱，使过多的脂质在肝细胞内沉积，导致肝脏脂肪变性发生炎症坏死和纤维化[6-8]。NF-κB作为一种可被炎症因子和反应性氧介导物激活的转录因子，参与了肝脏细胞的再生和凋亡等进程，而p65亚基及其磷酸化在NF-κB的激活中扮演了重要的角色[9]。大量的临床研究表明中医药治疗脂肪肝在降低血脂、改善肝功能、缓解临床症状等方面疗效显著[10-12]，可以弥补西药在治疗NAFLD的局限性。

我们通过阅读文献并结合大量非酒精性脂肪肝病患者的长期临床观察，认为非酒精性脂肪肝病为过食肥甘，损伤脾胃，脾虚气弱，失其“游溢精气”和“散精”功能，津液输布异常，导致脂肪堆积，溢于肌肤则为肥胖，积聚于肝则为脂肪肝。同时津液输布异常则水湿痰浊内生，痰阻气滞，气不行血，血行不畅成瘀血。因痰致瘀，因瘀致痰，痰瘀交阻亦导致脂肪肝的发生[13]。治疗应以健脾降浊、祛瘀化痰为法，降脂瘦身汤作为我科协定处方，经过多年的临床应用，被证实具有改善肥胖、降低体重、降低血脂的作用，对于非酒精性脂肪肝病具有较好的临床疗效。前期相关研究显示降脂瘦身汤能明确调节肥胖大鼠体重、空腹血糖、甘油三酯、转氨酶等生化指标。降脂瘦身汤重用生黄芪、党参补气健脾以升脾气治其本。方中丹参具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神的作用，现代药理研究证实其可增加肝血流量、改善肝内微循环，从而降低肝中脂肪的含量[14-15];方中桃仁活血化瘀、润肠通便，研究发现桃仁具有改善血流动力学、抗炎、提高免疫力等作用[16]。决明子、陈皮能调节肝脂代谢，抑制肝脏脂肪变性[17-18]。泽泻、山楂可通过改善血液黏稠度，增强与脂质代谢有关酶和蛋白的基因转录，从而发挥消脂作用[19-21]。诸药共行健脾降浊、祛瘀化痰的作用。

由此可见，降脂瘦身汤可下调NF-κB蛋白表达，阻止肝脏细胞脂肪变性，改善血清中Glu、FFA、TG、TC、INS的含量。但降脂瘦身汤作为中药复方制剂成分复杂，其治疗作用具有多靶点、多通道的特点，值得进一步深入探讨降脂瘦身汤治疗非酒精性脂肪肝的机制。