补肾活血祛痰方对高雄激素多囊卵巢综合征大鼠类固醇激素合成急性调节蛋白质因子的影响

周 杨，彭 聪，柯淑红，叶正华，刘亚琪

(1.武汉市第一医院内分泌科，湖北 武汉 430000；2.湖北中医药大学，湖北 武汉430065)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)是临床常见的一种妇科疾病，其具有不能治愈、疾病进展性等特点[1-3]。目前西医上主要采用药物和手术对PCOS进行治疗，其中药物主要为达英-35，虽然其疗效理想，但长期服药会引起糖耐量不足，乃至加重高胰岛素血症[4]。手术治疗创伤大，术后易发生并发症，患者接受度并不高。我国传统中医治疗PCOS疗效理想，且不良反应较少，被临床较广泛应用[5]。本文选择PCOS大鼠为模型，根据其发病机制，探讨补肾活血祛痰方对高雄激素PCOS大鼠卵巢组织中类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)的影响，以期为PCOS的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选用21日龄的SPF级雌性健康小鼠,动物批准号：SCXK(京)2020-0009,60只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，常规饲养于清洁级实验室中[室温(22±2)°C]。

1.1.2 药物：脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)；补肾活血祛痰方：生山楂30 g，枸杞子20 g，煅瓦楞子、当归各15 g，山茱萸、黄芩各9 g，经过水煎、过滤及浓缩成含生药1.0 g/ml浓度药液，-4 ℃保存待用。

1.1.3 主要试剂与仪器：黄体生成激素(Luteinizing hormone，LH)试剂盒、睾酮(Testosterone，T)试剂盒、StAR及GAPDH一抗、二抗、Western blot及凝胶电泳试剂；切片机、酶标检测仪、离心机、显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 分组方法：将60只大鼠随机分为对照组和中药组，各30只。

1.2.2 造模和给药：所有大鼠采用DHEA注射建立PCOS模型，每日注射DHEA，剂量：6 mg/100 g体重，同时注射0.2 ml油剂，连续20 d；第11天，采用阴道脱落细胞涂片检查2个性周期(每周期为5 d)，当持续出现阴道上皮基底层细胞，且阴道角化细胞未曾出现，阴道脱落细胞失去完整动情周期，则判定造模成功。造模成功后，中药组给予补肾活血祛痰方治疗：补肾活血祛痰方灌胃，1次/d，每次剂量为25 mg/(kg·d)，连续灌胃22 d，对照组给予等量的0.9 %氯化钠溶液灌胃。

1.2.3 标本采集：末次给药后，大鼠禁食过夜，第2天水合氯醛(10%)麻醉，采集其眼眶后静脉血，离心机离心10 min(2500 r/min)，收集血清，-80 ℃超低温冰箱保存，采用颈椎脱臼法处死大鼠，取其卵巢，常规固定和脱水后，石蜡包埋切片。

1.3 观察项目及方法

1.3.1 卵巢组织形态学观察：石蜡包埋切片进行HE染色，将切片放置入Harris苏木素染中5 min，给予苏木素染细胞核；然后切片置入伊红染液中染色3 min，酒精梯度脱水，然后中性树胶封片，镜下观察各组大鼠卵巢形态学情况，包括卵泡、黄体、颗粒细胞的变化情况。

1.3.2 血清激素及炎症水平测定：采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中LH、T、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达水平，严格按照说明书进行操作，酶标仪读取OD值(15 min内)，并计算出LH、T、IGF-Ⅰ和TNF-α水平。

1.3.3 Western blot检测StAR蛋白表达：改良异硫氰酸胍法提取总蛋白，然后测定蛋白浓度(Bradford比色法)，调整各组蛋白浓度，保持一致，变性处理，电泳分离蛋白，转印后，置入封闭液中摇动孵育1 h，加入一抗(1∶1000稀释)孵育，4 ℃下过夜。二抗(1∶2000稀释)孵育2 h，免疫荧光增强法显色，StAR蛋白的表达量与GAPDH的灰度比值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组大鼠卵巢组织形态情况 见表1(图1)。HE染色结果显示，对照组卵泡呈囊性扩张，囊状卵泡内卵母细胞消失，可见多个空卵泡，颗粒细胞排列极为紊乱；中药组可见少数囊泡细胞，可见到少数初级卵母细胞、次级卵母细胞、生长卵泡以及成熟卵泡，颗粒细胞数目较对照组增多，卵泡的颗粒细胞层次多，且排列较规则，治疗22 d后，中药组的卵泡及黄体数明显多于对照组(均P<0.05)。

图1 两组大鼠卵巢组织形态(HE染色,×200)

表1 两组大鼠卵泡数及黄体数(个)

2.2 两组大鼠血清激素水平比较 见表2。治疗22 d后，中药组血清LH和T水平比对照组明显降低(均P<0.05)。

表2 两组大鼠血清激素水平比较

2.3 两组大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比较 见表3。治疗22 d后，中药组血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比对照组明显降低(均P<0.05)。

表3 两组大鼠血清IGF-Ⅰ和TNF-α水平比较

2.4 两组大鼠卵巢组织中StAR蛋白的表达情况比较 见图2。Western blot结果显示，治疗22 d后，中药组卵巢组织中StAR蛋白表达(0.483±0.027)明显比对照组(0.837±0.035)降低(P<0.05)。

1、2为对照组；3、4为中药组

3 讨 论

PCOS是女性最常见的一种机体代谢紊乱性疾病，以高雄激素血症、脂代谢紊乱及高胰岛素血症为特征，会引起患者闭经、激素水平异常增高及不孕症状[6-7]。PCOS的发病机制目前尚未完全清楚，内分泌失调、胰岛素抵抗等因素均可导致其发病[8-9]。高雄激素血症会阻碍PCOS患者卵泡成熟，使卵泡闭锁，导致发生囊性病变[10]。PCOS在我国传统中医中属于“闭经”“癥瘕”“不孕”“崩漏”范畴，认为其发病机制为，患者肾精亏虚、肾气虚衰导致排卵稀发或不排卵，肾虚日久导致任脉不通、冲脉不足，经血不能汇集下注胞宫，导致月经后期，甚至闭经[11]。因此治疗以补肾为主，兼活血化瘀，祛湿除痰[12]。

卵巢是女性储备卵子及产生激素的生殖器官，卵泡是其最基本功能单位，承担着储备营养物质与传递遗传物质的作用[13]。补肾活血祛痰方由生山楂、枸杞子、煅瓦楞子、当归、山茱萸、黄芩组成。其中生山楂具有活血化瘀、消食化积的功效；枸杞子具有滋补肝肾、明目润肺的效果；煅瓦楞子可起到化瘀散结、消痰软坚的作用；当归具有补血活血调经的功效；山茱萸具有涩精固脱、补肝肾的功效；黄芩具有泻火解毒、清热燥湿的作用，以上诸药共用，可起到补肾活血、祛痰利湿的效果[14-15]。本研究将其用于PCOS大鼠身上，研究结果发现，给药治疗22 d后，中药组卵泡颗粒细胞数目较对照组增多，卵泡的颗粒细胞层次多，且排列较规则，卵泡及黄体数明显多于对照组，这说明了补肾活血祛痰方可明显促进大鼠卵泡的发育，诱发排卵，改善黄体形成，并改善卵巢组织形态结构，从而改善卵巢的生殖功能。

高雄激素血症可以引起机体下丘脑-垂体-卵巢轴功能发生紊乱，导致LH水平升高，使高雄激素的活性增强，促进PCOS患者的卵巢分泌雄激素，加重高雄激素血症[16-17]。现代药理学认为[18-19]，山楂、当归这些活血化瘀药中的有效成分可改善微循环，增加血流量，改善组织供养；枸杞子等补肾类药物可调节下丘脑-垂体-卵巢轴功能，起到类雌激素样作用。StAR是一种甾体类生成快速调节蛋白，其在甾体激素产生的过程中起到关键作用，对调控血清激素水平有着重要作用[20]。当IGF-Ⅰ水平异常升高时，IGF-Ⅰ的类似胰岛素功能也发生变化，机体新陈代谢异常、雄激素水平上升，增加胰岛素抵抗，导致PCOS发生。TNF-α是重要的促炎细胞因子之一，且在PCOS的患者中表达增高。本研究结果显示，治疗后，中药组血清LH和T水平比对照组明显降低，中药组StAR蛋白表达明显比对照组降低，这可能是因为通过补肾活血祛痰方治疗，可增强卵巢局部血液循环，增进其血流量，改善胰岛素抵抗，调控血清激素水平，减轻胰岛素抵抗；通过改善卵巢局部环境，影响StAR和类固醇激素及其合成酶的合成，下调StAR蛋白的表达。

综上所述，补肾活血祛痰方可有效降低高雄激素PCOS大鼠血清激素水平，下调StAR蛋白的表达，改善卵巢功能，可为临床治疗PCOS提供一定的实验依据。