MTHFR MTRR基因多态性及血同型半胱氨酸水平与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性

许小伟 谢海洋 秦延昆 邵祥忠 曹 建

脑梗死是临床常见的一种脑血管病症，主要是由于脑供血突然中断引起，可由动脉粥样硬化诱发。血同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平与动脉粥样硬化性脑梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的发生发展存在密切联系。亚甲基四氢叶酸还原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase，MTRR)是影响Hcy代谢水平的关键作用酶。目前，关于MTHFR基因及MTRR基因、血浆Hcy水平、颈动脉粥样硬化性脑梗死三者的关系尚存在一定的争议，部分学者认为MTHFR基因及MTRR基因发生突变，可导致血浆Hcy水平显著提高，而高水平Hcy可引发颈动脉内弹力层断裂，诱导血管平滑肌细胞迁移增殖，改变血小板功能及凝血系统，最终诱发动脉粥样硬化。亦有学者认为MTHFR基因突变虽然可导致血浆Hcy水平提高，但其和动脉粥样硬化性脑梗死并无显著相关性。因此，本研究主要探究MTHFR、MTRR基因多态性及血Hcy水平与ACI的相关性，旨在为ACI的临床防治提供更多参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月至2020年10月就诊于海安市人民医院的45例ACI患者作为观察组，另选取同期于海安市人民医院进行健康体检、并经颈动脉彩超检查证实无动脉粥样硬化的非ACI体检者40例作为对照组。两组研究对象性别、年龄、身体质量指数(body mass index, BMI)、吸烟、饮酒、糖尿病及冠状动脉粥样硬化性心脏病患病情况，差异均无统计学意义(

P

>0.05)，观察组高脂血症及高血压比例高于对照组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

续表1

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：①参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中ACI诊断标准，观察组患者均确诊为脑梗死；②参照急性卒中治疗低分子肝素试验(trial of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST)分型标准和经颈动脉彩超检查，观察组患者均确诊为大动脉粥样硬化性脑梗死；③临床资料完整的受试者；④受试者或家属均签定知情同意书。

排除标准：①合并肿瘤、恶性贫血、甲状腺疾病、肝肾功能障碍、慢性胃肠道疾病等影响Hcy水平的疾病；②合并严重心脏疾病；③近期服用过叶酸、茶碱、甲氨蝶呤等；④中途退出研究者。

1.3 研究方法

1.3.1 样本DNA的采集和基因分型 所有研究对象抽取空腹肘静脉血1 mL，置于抗凝管中，采用基因组DNA提取试剂盒(上海博升生物科技有限公司)，按照操作说明提取受试者DNA。采用Taqman-MGB探针法对MTHFR 677C/T(rs1801133)、MTHFR 1298A/C(rs1801131)、MTRR 66A/G(rs1801394)基因多态性进行检测，所用试剂和仪器均由上海恒斐生物科技有限公司提供。再分别对上述三个位点行荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，其反应体系的总体积均为10 μL，包括了1 μL 20 ng/μL DNA模板、5 μL 2×TaqMan Universal Master Mix、0.5 μL 20×TaqManMGB探针、3.5 μL去离子水。在95℃ 10 min条件下反应，95℃ 15 s、60℃ 1 min条件下扩增，共20个循环；最后在89℃ 15 s、60℃ 90 s条件下扩增，共30个循环。待反应结束，即在荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪(美国ABI公司，型号：7900)对样本孔终点荧光进行读取，通过分析软件对各样本基因分型的结果进行确定。

1.3.2 血Hcy的检测 所有研究对象入组后，抽取空腹肘静脉血4 mL，置于EP管内，在常温下静置1 h后，采用离心法分离血清，于-80℃保存待测。采用自动生化分析仪(江苏英诺华医疗技术有限公司)检测Hcy水平。

1.4 资料整理和观察指标 收集两组研究对象一般资料，包括性别、年龄、吸烟、饮酒、高脂血症、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、血Hcy水平，以及MTHFR、MTRR基因型分布情况等。①比较两组MTHFR和MTRR基因型分布情况；②比较两组血Hcy水平；③分析ACI发生的独立危险因素。

2 结果

2.1 两组研究对象MTHFR和MTRR基因型比较 观察组对象MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型与对照组存在差异(

P

<0.05)，而两组对象MTHFR rs1801131基因型差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表2。

表2 两组研究对象MTHFR和MTRR基因型分布情况比较[例(%)]

2.2 两组研究对象血Hcy水平的比较 观察组血Hcy水平为(18.02±0.62)μmol/L，对照组为(7.35±0.10)μmol/L，差异具有统计学意义(

t

=13.864，

P

<0.001)。2.3 ACI发生的多因素分析 将单因素分析有差异的因素纳入多因素logistic回归分析中，包括高脂血症、高血压、血Hcy水平、MTHFR rs1801133基因型、MTRR rs1801394基因型，赋值见表3。结果显示，高脂血症、高血压、血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI发生的独立危险因素(

P

<0.05)。见表4。

表3 ACI危险因素logistic回归分析变量赋值表

表4 ACI危险因素logistic回归分析

3 讨论

我国ACI发病率呈上升趋势，严重威胁人民群众身体健康和生命安全。高水平Hcy是多种心脑血管疾病发病的独立危险因素，当Hcy水平异常升高、MTHFR和MTRR发生基因突变时，即会引发高水平Hcy。本研究就MTHFR和MTRR基因多态性及血Hcy水平与ACI疾病发生的相关性进行分析，以期为预防ACI的发生提供参考。

目前，关于ACI发病的危险因素研究较多，但不同学者结果不尽相同，笪正等通过回顾性分析446例急性脑梗死患者的临床资料，发现急性脑梗死发病与患者年龄、基线收缩压、卒中严重程度、C反应蛋白以及责任动脉闭塞关系密切。刘磊等通过分析78例急性脑梗死的临床资料，发现血清超敏C反应蛋白、纤维蛋白原、低密度脂蛋白是急性脑梗死发病的危险因素，其中血清超敏C反应蛋白可作为急性脑梗死患者病情严重程度的判定指标。然而大多数研究并未将MTHFR和MTRR基因型纳入急性脑梗死危险因素分析中。本研究结果显示，高脂血症、高血压是ACI发生的独立危险因素，其中高血脂是动脉内斑块形成、动脉粥样硬化及动脉管腔狭窄的重要原因，而高血压可加大动脉壁环状扩展范围，提高颅内动脉壁剪应力，进而改变张应力和血流，最终诱发动脉粥样硬化形成，针对ACI发病高危人群，应当平稳的控制血压及血脂水平。

本研究结果显示，血Hcy水平>15 μmol/L、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因亦是ACI发生的独立危险因素，Hcy是机体蛋氨酸代谢过程中所产生的一种含硫氨基酸，虽然目前发现血浆Hcy水平与脑梗死患者神经功能缺损程度、脑梗死分型无明显相关性，但证实高水平Hcy是脑血栓形成独立危险因素。高水平的Hcy引发ACI的机制较为复杂，包括损伤脑血管内皮细胞、增加颅内动脉远端阻力、影响凝血纤溶系统、促进脂质过氧化反应、促进平滑肌细胞增殖等。而MTHFR是Hcy再甲基化成为蛋氨酸代谢过程中的关键酶，MTHFR C677T基因突变的纯合子TT可降低MTHFR活性，引起血Hcy水平的升高，促进高水平Hcy的发生及发展，最终诱导ACI的发生。其等位基因与动脉中弹力层的断裂发生密切相关，在动脉粥样硬化的形成中，T基因能够将平滑肌细胞迁至内膜，对ACI的发生及发展起到了促进作用。MTRR基因位于5p15.2～15.3，主要多态性即为66A→G，即异亮氨酸取代了蛋氨酸，MTRR参与了蛋氨酸合成酶(methionine synthase，MS)活性的恢复，其能够有效维持细胞中四氢叶酸和蛋氨酸水平，而MS又是机体代谢Hcy的关键酶，因此MTRR发生基因突变也会引起Hcy水平异常升高，继而促进ACI的发生。

综上所述，高脂血症、高血压、高水平Hcy、MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是ACI发生的独立危险因素，临床应采取针对性预防干预措施，以降低ACI的发生风险。然而本研究样本量较小，结果仍需大样本、高质量、多中心研究进一步证实。此外MTRR 677C/T TT基因、MTRR 66A/G GG基因是否能通过其他途径影响ACI的发生及发展仍需进一步探索。