马钱子总生物碱修复膝骨关节炎大鼠软骨损伤的效果观察及作用机制研究

王明喜，张丽霞，王长平

(安阳市中医院，河南 安阳 455000)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以膝关节软骨退变和损伤为主要病理特征的慢性退行性疾病，临床主要表现为膝关节疼痛、肿胀、功能障碍等[1-2]。该病好发于老年人，严重影响患者的生活质量[3]。修复受损的软骨是治疗KOA的主要方法[4]，临床采用膝关节腔注射透明质酸等药物治疗KOA，在一定程度上能够缓解膝部疼痛、改善膝关节活动度，然而对于软骨损伤修复效果甚微[5-9]。中药在修复软骨损伤方面表现出一定的优势，马钱子常用于治疗骨关节炎，能够促进软骨损伤修复，临床疗效显著[10-12]。马钱子的主要有效成分是马钱子总生物碱，其修复软骨损伤的作用机制尚不明确。为了探讨马钱子总生物碱修复KOA软骨损伤的效果及作用机制，我们建立了大鼠KOA模型，并进行了相关实验研究，现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物12周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量(220±10)g，购自广东省科学院健康医学研究所，实验动物许可证号：SYXK(粤)2018-0183。实验方案通过医学动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验试剂木瓜蛋白酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，苏木精伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色试剂盒、放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)缓冲液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测试试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，马钱子总生物碱(丽珠集团利民制药公司)，塞来昔布胶囊(美国辉瑞公司)，戊巴比妥钠(上海信裕生物科技有限公司)，福尔马林(济南百博生物技术股份有限公司)，Trizol试剂、PrimeScript TM RT试剂盒(日本Takara公司)，SYBR-Green定量PCR预混试剂(北京康润诚业生物科技有限公司)，引物由生工生物工程股份有限公司合成，兔抗鼠基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-13、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β、β-联蛋白(β-catenin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(上海赛信通生物试剂有限公司)，UltraSignal超敏化学发光底物(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 实验仪器7300实时定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)仪(美国ABI)，Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国Bio-rad)，DM4000B光学显微镜(LEICA公司)。

2 方 法

2.1 造模及模型鉴定方法采用随机数字表将60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、塞来昔布组和马钱子总生物碱低、中、高剂量组，每组10只。模型组、塞来昔布组和马钱子总生物碱低、中、高剂量组，均于大鼠双侧后肢膝关节腔注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每隔2 d注射1次，共注射3次[6]。第3次注射后，每天驱使大鼠活动2 h。于温度(22±2)℃、湿度50%～60%条件下继续正常饲养1周后，从各组中随机选取1只大鼠，处死后取膝关节软骨，制备石蜡切片，HE染色后，于直视和显微镜下观察，判断造模是否成功。

2.2 干预方法造模成功后，开始进行药物干预。马钱子总生物碱低、中、高剂量组大鼠分别以马钱子总生物碱混悬液进行灌胃，每日剂量分别为50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和150 mg·kg-1；塞来昔布组大鼠以塞来昔布溶液进行灌胃(塞来昔布胶囊粉剂溶于去离子水中)，每日剂量为24 mg·kg-1；正常对照组和模型组大鼠以生理盐水进行灌胃，每日1 mL。所有大鼠均于温度(22±2)℃、湿度50%～60%条件下正常饲养。

2.3 膝关节软骨损伤程度评价方法药物干预6周后，于大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，采用颈椎脱臼法处死大鼠。每只大鼠取双侧后肢膝关节(股骨远端1/4至胫骨近端1/4)，左侧膝关节于-80 ℃储存备用，右侧膝关节用于软骨损伤程度评价。将右侧膝关节于10%中性福尔马林固定液中固定；1周后，取出膝关节，用PBS冲洗，放入乙二胺四乙酸粉末中脱钙。4周后，使用乙醇进行梯度脱水，采用石蜡包埋，沿矢状面切片，厚度5 μm。PBS冲洗后，加入HE染色，封片，于显微镜下进行病理学检查。采用Mankin’s评分法[13]评价膝关节软骨损伤程度。

2.4 膝关节软骨损伤及Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达分析方法根据膝关节软骨损伤程度评价结果，选取马钱子总生物碱低、中、高剂量组中软骨修复效果最佳的1组以及正常对照组、模型组和塞来昔布组进行膝关节软骨损伤相关基因mRNA和蛋白的表达分析。从上述4组中分别取5只大鼠的单侧膝关节，收集软骨组织，采用Trizol法分别提取总RNA。采用PrimeScript TM RT试剂盒反转录获得cDNA。采用SYBR-Green定量PCR预混试剂进行RT-qPCR，PCR扩增引物见表1，扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸30 s，40个循环。以GAPDH作为内参基因，并采用2-ΔΔCT计算膝关节软骨损伤相关基因mRNA的相对表达量。

表1 PCR扩增引物序列

2.5 膝关节软骨损伤及Wnt/β-catenin信号通路相关基因蛋白表达分析方法从正常对照组、模型组、塞来昔布组及马钱子总生物碱中剂量组中分别取5只大鼠的单侧膝关节，收集软骨组织。分别研磨后，采用裂解混悬液(RIPA缓冲液∶PMSF=1∶100)提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。调整样品蛋白浓度一致后，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，加入3%的BSA溶液于室温下封闭2 h。采用TBST洗膜3次，每次10 min。加入兔抗鼠MMP-9、MMP-13、IL-1β、β-catenin、GSK-3β和GAPDH一抗，于4 ℃过夜孵育，抗体使用比例均为1∶1000。再用TBST洗涤3次，每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G二抗于室温下孵育2 h，抗体使用比例为1∶4000。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入UltraSignal超敏化学发光底物覆盖膜，室温孵育1 min，将膜放入凝胶成像仪显影并拍照。采用Image J图像处理软件处理图片，并提取蛋白条带的灰度值，并分别以GAPDH蛋白为基准进行标准化处理，计算蛋白条带的相对灰度值，分析蛋白表达水平。

2.6 数据统计方法采用SPSS24.0统计软件处理数据。各组大鼠Mankin’s评分和MMP-9、MMP-13、IL-1β、β-catenin、GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量的组间比较均采用单因素方差分析，组间两两比较均采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 模型鉴定结果造模完成1周后，直视下观察，正常大鼠膝关节软骨呈胶冻样，表面光滑；KOA模型大鼠膝关节软骨色泽暗淡，表面粗糙。膝关节软骨组织切片显示，正常大鼠膝关节软骨组织结构完整、潮线清晰，软骨细胞均匀分布；KOA模型大鼠膝关节软骨组织结构模糊，潮线不完整或丢失，软骨细胞聚集，排列紊乱,提示造模成功。见图1。

图1 造模完成1周后大鼠膝关节软骨组织HE染色图片(×200)

3.2 膝关节软骨组织病理学检查结果药物干预6周后，正常对照组大鼠膝关节软骨组织结构完整、潮线清晰，软骨细胞均匀分布；模型组大鼠膝关节软骨组织结构破坏严重，潮线模糊，软骨细胞聚集；马钱子总生物碱低、中、高剂量组大鼠膝关节软骨组织结构可辨识，软骨细胞聚集现象较模型组减少，且马钱子总生物碱中剂量组的大鼠软骨改善效果最明显；塞来昔布组大鼠膝关节软骨组织结构较完整、清晰，软骨细胞聚集现象不明显。见图2。

图2 干预6周后6组大鼠膝关节软骨组织HE染色图片(×200)

3.3 膝关节软骨损伤Mankin’s评分结果6组大鼠膝关节软骨损伤Mankin’s评分的组间差异有统计学意义[(0.28±0.20)分，(8.97±0.46)分，(7.12±0.23)分，(3.23±0.18)分，(6.21±0.25)分，(0.77±0.17)分，F=8.025，P=0.000]。正常对照组和马钱子总生物碱低、中、高剂量组及塞来昔布组的大鼠膝关节软骨损伤Mankin’s评分均低于模型组(LSD-t=54.785，P=0.000；LSD-t=11.316；P=0.000；LSD-t=36.747，P=0.000；LSD-t=16.671，P=0.000；LSD-t=21.626，P=0.000)；马钱子总生物碱低、中和高剂量组的大鼠膝关节软骨损伤Mankin’s评分均高于塞来昔布组(LSD-t=70.210，P=0.000；LSD-t=31.420，P=0.000；LSD-t=56.902，P=0.000)；马钱子总生物碱中剂量组的大鼠膝关节软骨损伤Mankin’s评分低于马钱子总生物碱低、高剂量组(LSD-t=42.119；P=0.000；LSD-t=30.590；P=0.000)。

3.4 软骨损伤相关基因mRNA和蛋白表达分析结果正常对照组、模型组、塞来昔布组及马钱子总生物碱中剂量组4组大鼠膝关节软骨组织中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相对表达量的组间差异均有统计学意义。模型组大鼠膝关节软骨组织中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相对表达量均高于正常对照组(mRNA相对表达量：LSD-t=18.189，P=0.000；LSD-t=16.741，P=0.000；LSD-t=16.887P=0.000；蛋白相对表达量：LSD-t=12.731，P=0.000；LSD-t=25.484，P=0.000；LSD-t=16.887，P=0.000)。马钱子总生物碱中剂量组和塞来昔布组大鼠膝关节软骨组织中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相对表达量均低于模型组(mRNA相对表达量：LSD-t=16.215，P=0.000；LSD-t=13.825，P=0.000；LSD-t=12.146，P=0.000；LSD-t=10.743，P=0.000；LSD-t=15.539，P=0.000；LSD-t=29.503，P=0.000；蛋白相对表达量：LSD-t=17.607，P=0.000；LSD-t=15.215，P=0.000；LSD-t=13.552，P=0.000；LSD-t=10.896，P=0.000；LSD-t=35.078，P=0.000；LSD-t=30.727，P=0.000)。马钱子总生物碱中剂量组大鼠膝关节软骨组织中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相对表达量与塞来昔布组比较，组间差异均无统计学意义(mRNA相对表达量：LSD-t=1.107，P=0.323；LSD-t=1.357，P=0.192；LSD-t=1.614，P=0.124；蛋白相对表达量：LSD-t=1.698，P=0.107；LSD-t=0.947，P=0.356；LSD-t=1.175，P=0.255)。见表2和图3。

表2 4组大鼠膝关节软骨组织中软骨损伤相关基因mRNA和蛋白相对表达量

(1)正常对照组；(2)模型组；(3)塞来昔布组；(4)马钱子总生物碱中剂量组；MMP：基质金属蛋白酶；IL：白细胞介素；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

3.5 Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA和蛋白表达分析结果正常对照组、模型组、塞来昔布组及马钱子总生物碱中剂量组4组大鼠膝关节软骨组织中GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白相对表达量的组间差异有统计学意义。模型组大鼠膝关节软骨组织中β-catenin的mRNA和蛋白相对表达量均高于正常对照组(LSD-t=17.657，P=0.000；LSD-t=29.000，P=0.000)；模型组大鼠膝关节软骨组织中GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量均低于正常对照组(LSD-t=21.535，P=0.000；LSD-t=15.707，P=0.000)；马钱子总生物碱中剂量组和塞来昔布组大鼠膝关节软骨组织中β-catenin的mRNA和蛋白相对表达量均低于模型组(mRNA相对表达量：LSD-t=13.117，P=0.000；LSD-t=35.420，P=0.000；蛋白相对表达量：LSD-t=14.906，P=0.000；LSD-t=34.192，P=0.000)；马钱子总生物碱中剂量组和塞来昔布组大鼠膝关节软骨组织中GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量高于模型组(mRNA相对表达量：LSD-t=10.941，P=0.000；LSD-t=13.446，P=0.000；蛋白相对表达量：LSD-t=11.461，P=0.000；LSD-t=16.578，P=0.000)；马钱子总生物碱中剂量组大鼠膝关节软骨组织中β-catenin和GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量与塞来昔布组比较，组间差异无统计学意义(mRNA相对表达量：LSD-t=0.591，P=0.562；LSD-t=0.797，P=0.436；蛋白相对表达量：LSD-t=0.243，P=0.811；LSD-t=1.762，P=0.094)。见表3和图4。

表3 4组大鼠膝关节软骨组织Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA和蛋白相对表达量

(1)正常对照组；(2)模型组；(3)塞来昔布组；(4)马钱子总生物碱中剂量组；GSK-3β：糖原合成酶激酶；β-catenin：β-联蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

4 讨 论

研究表明，KOA膝关节软骨损伤与炎症反应密切相关[14]。炎症因子IL-1β过量表达会加剧KOA的炎症反应和软骨退化[15]。MMP-9和MMP-13能够降解细胞外基质，加剧膝骨关节软骨的破坏，促进KOA的发生和发展[16-18]。本研究结果显示，模型组MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白表达量均高于正常对照组，而以剂量100 mg·kg-1的马钱子总生物碱进行灌胃治疗后，这些基因的表达量均低于模型组，且和塞来昔布组相关基因的mRNA和蛋白表达量相当；提示马钱子总生物碱能够通过抑制MMP-9、MMP-13和IL-1β的表达修复膝关节软骨损伤，治疗KOA。

Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路中的经典信号通路，主要参与调节软骨细胞的增殖、分化、凋亡以及软骨基质的分解代谢[19-20]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中重要的细胞内信号分子，GSK-3β能够使β-catenin磷酸化，导致β-catenin失去活性，使Wnt/β-catenin信号通路被抑制；当Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt蛋白与跨膜受体Lrp5/6结合，抑制GSK-3β活性，导致β-catenin在细胞核内聚集，与T细胞转录因子或淋巴增强转录因子结合，形成转录复合物，激活软骨细胞中MMP-9、MMP-13和IL-1β等基因的表达[21-25]。本实验结果显示，与正常对照组比较，模型组β-catenin的mRNA和蛋白相对表达量升高，而GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量降低，提示Wnt/β-catenin信号通路被激活；与模型组比较，塞来昔布组和马钱子总生物碱中剂量组中β-catenin的mRNA和蛋白相对表达量降低，而GSK-3β的mRNA和蛋白相对表达量升高，提示Wnt/β-catenin信号通路被抑制。因此，马钱子总生物碱治疗大鼠KOA可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制炎症反应，促进KOA大鼠膝关节软骨损伤的修复。

本研究的结果表明，马钱子总生物碱能够有效修复KOA大鼠软骨损伤，其修复效果与剂量有关；马钱子总生物碱能够抑制大鼠膝关节软骨组织MMP-9、MMP-13、IL-1β及β-catenin的mRNA和蛋白表达，促进GSK-3β的mRNA和蛋白表达，且与塞来昔布的效果相当；马钱子总生物碱抑制Wnt/β-catenin信号通路可能是其修复膝关节软骨损伤的作用机制之一。