大鼠肾虚型椎间盘软骨终板退变病证结合模型的构建与评价

夏炳江，沈兴潮，胡松峰，韦金忠，许杨

(绍兴市中医院，浙江 绍兴 312000)

软骨终板(cartilage endplate，CEP)退变被认为是椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)的始动因素[1-2]，研究CEP退变可为早期防治IDD提供新的理论依据。中医学认为“肾虚”为腰痛的关键病机[3]，补肾中药治疗与IDD相关的疾病具有独特优势[4]，但要进一步探讨其作用机制或对其有效性和安全性进行验证，尚需进行大量的动物实验。病证结合动物模型以疾病模型为基础，具有较好的可靠性和稳定性，同时引入“证候”概念，能很好体现中医“证候”的阶段性及动态性变化，是研究中医临床疾病的良好平台和载体[5]。目前，在CEP退变的研究领域尚缺乏适宜于中医药研究的病证结合动物模型。本文拟通过切除大鼠双侧卵巢并结合阻断CEP营养供应法而构建肾虚型CEP退变病证结合动物模型，以进一步研究病与证之间的内在规律。

1 材料与仪器

1.1 实验动物12周龄SPF级雌性SD大鼠108只，体质量(200±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK(浙)2008-0115。所有大鼠普通颗粒饲料喂养，自然光照，自由进食进水。实验方案通过医院医学伦理委员会审查通过。

1.2 实验仪器与试剂组织脱水机(日本樱花公司)，轮转式切片机(德国Leica公司)，荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain recation，PCR)仪(美国ABI公司)，普通PCR仪(德国Eppendorf公司)，多光谱小动物活体成像仪(美国Carestream Health公司)，Micro-CT(瑞士Scanco Medical AG公司)，反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)，定量试剂盒(大连TaKaRa公司)，PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

2 方 法

2.1 动物分组与造模将108只大鼠，按随机区组设计原则，随机分为空白组、CEP退变模型组和病证结合模型组，每组36只。CEP退变模型组大鼠采用椎间盘CEP下骨质无水酒精注射阻断CEP营养供应法构建CEP退变模型，具体方法如下：以氯胺酮(0.1 g·kg-1)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，在X线透视仪的辅助下定位手术区域[图1(1)]。取大鼠尾部背侧正中纵形切口，长1～1.5 cm，切开皮肤、皮下组织，显露椎体上、下方的CEP及椎间盘[图1(2)]。分别于椎体两端距离CEP 1～2 mm处，用直径0.6 mm的硬质针行局部椎体内穿刺至骨髓腔[图1(3)]，针尾连接注射器，通过加压作用注入50 μL无水酒精。利用无水酒精的去血管化作用，使椎体内骨髓血管内皮细胞迅速脱水、蛋白变性凝固，小血管闭塞，从而造成微循环的破坏，CEP营养供应阻断。病证结合模型组大鼠采用摘除大鼠双侧卵巢结合椎间盘CEP下骨质无水酒精注射阻断CEP营养供应法构建肾虚型CEP退变病证结合模型。CEP退变模型组与病证结合模型组大鼠术后均肌肉注射1万单位青霉素预防感染，每天1次，持续3 d，分笼常规饲养，自由活动。空白组大鼠不做任何处理。

图1 椎间盘软骨终板退变模型构建过程

2.2 肾虚模型鉴定

2.2.1大鼠表观特征观察和肾虚症状体征量化评分测定 造模后观察并记录大鼠表观特征，包括大鼠毛发光泽度、饮水、精神状态、大便性状、活动状态等情况，结合文献[6]拟定大鼠肾虚症状体征量化评分表(表1)进行评分测定。

表1 大鼠肾虚症状体征量化评分表

2.2.2尾椎骨密度与骨微结构指标测算 分别于造模后4周、8周，从各组随机抽取6只大鼠，以氯胺酮(0.1 g·kg-1)行腹腔注射麻醉后，采用多光谱小动物活体成像仪摄尾椎X线片，并利用成像仪自带软件测算尾椎骨密度。然后，采用二氧化碳窒息法处死大鼠，仔细分离软组织，取出尾椎，修剪去除椎体附件后将其固定在Micro-CT载物台上，采用Micro-CT扫描大鼠尾椎的骨微结构，选取感兴趣区域骨小梁的三维结构，应用N-Recon软件、CT-AN软件测算骨小梁数目(trabecular number，TN)、骨小梁分离度(trabecular separation，TS)、骨小梁厚度(trabecular thickness，TT)。

2.3 椎间盘CEP退变模型鉴定

2.3.1组织病理学观察 分别于造模后4周、8周，从各组随机抽取6只大鼠，切取造模椎间盘(连同其上、下部分椎体组织)，10%磷酸盐缓冲液甲醛固定72 h，14%乙二胺四乙酸脱钙2周，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚约5 μm，HE染色观察各组大鼠椎间盘CEP组织退变情况。

2.3.2椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表达检测 分别于造模后4周、8周，从各组随机抽取6只大鼠，仔细分离造模椎间盘CEP组织，利用液氮迅速冷冻后将其研磨成粉。利用Trizol提取液提取总RNA，以实时定量PCR法检测椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type Ⅰ motifs，ADAMTS)-5基因表达量。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参基因，引物序列见表2。目标基因的基因表达量采用2-ΔΔCT法与GAPDH的表达水平进行校正。

表2 大鼠椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因引物

2.4 数据统计学处理采用SPSS13.0统计软件对所得数据进行统计学分析。3组大鼠肾虚症状体征量化评分的比较采用重复测量资料的方差分析；3组大鼠尾椎骨密度、骨微结构指标以及聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表达量的组间总体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 一般情况在造模过程中，所有大鼠均无意外死亡发生。CEP退变模型组1只大鼠术后3 d出现尾部切口愈合不良、坏死现象[图2(1)]，换药后1周左右切口愈合；其余大鼠尾部切口均愈合良好[图2(2)]。

图2 大鼠术后尾部皮肤切口外观

3.2 肾虚模型鉴定结果

3.2.1大鼠表观特征 造模后，空白组与CEP退变模型组大鼠毛发柔顺有光泽，饮食适量，两眼有神，大便软硬适中，抓取时反抗有力，不易激惹；病证结合模型组大鼠逐渐出现毛发枯槁易脱落、饮食增多、精神倦怠、两眼无神、大便干结变硬、活动减少、反应迟钝等肾虚的表现。

3.2.2肾虚症状体征量化评分 时间因素和分组因素存在交互效应。3组大鼠肾虚症状体征量化评分总体比较，差异有统计学意义，即存在分组效应。造模后不同时间点大鼠肾虚症状体征量化评分的差异有统计学意义，即存在时间效应。造模后，3组大鼠肾虚症状体征量化评分随时间变化趋势不一致，空白组大鼠肾虚症状体征量化评分随时间未见明显变化，

CEP退变模型组和病证结合模型组大鼠肾虚症状体征量化评分随时间均呈升高趋势。造模后2周，3组大鼠肾虚症状体征量化评分比较，差异无统计学意义。造模后4周、6周、8周，3组大鼠肾虚症状体征量化评分比较，组间差异均有统计学意义；空白组和CEP退变模型组大鼠肾虚症状体征量化评分均低于病证结合模型组(造模后4周：LSD-t=4.082，P=0.002； LSD-t=4.491，P=0.001。造模后6周：LSD-t=6.725，P=0.000；LSD-t=7.206，P=0.000。造模后8周：LSD-t=8.485，P=0.000；LSD-t=8.132，P=0.000)；空白组与CEP退变模型组大鼠肾虚症状体征量化评分比较，组间差异均无统计学意义(造模后4周：LSD-t=0.408，P=0.690；造模后6周：LSD-t=0.480，P=0.640；造模后8周：LSD-t=0.354，P=0.730)。见表3。

表3 3组大鼠肾虚症状体征量化评分

3.2.3尾椎骨密度 造模后4周，3组大鼠尾椎骨密度比较，差异有统计学意义；空白组和CEP退变模型组大鼠尾椎骨密度均高于病证结合模型组(LSD-t=3.682，P=0.003；LSD-t=3.028，P=0.011)；空白组大鼠尾椎骨密度与CEP退变模型组比较，差异无统计学意义(LSD-t=0.655，P=0.525)。造模后8周，3组大鼠尾椎骨密度比较，差异有统计学意义；空白组和CEP退变模型组大鼠尾椎骨密度均高于病证结合模型组(LSD-t=3.749，P=0.003；LSD-t=3.035，P=0.010)；空白组大鼠尾椎骨密度与CEP退变模型组比较，差异无统计学意义(LSD-t=0.714，P=0.489)。见表4。

表4 3组大鼠尾椎骨密度

3.2.4骨微结构指标 造模后4周，3组大鼠TN、TS比较，组间差异均具有统计学意义；空白组和CEP退变模型组大鼠TN高于病证结合模型组(LSD-t=12.991，P=0.000；LSD-t=10.657，P=0.000)，TS低于病证结合模型组(LSD-t=4.623,P=0.001；LSD-t=2.736，P=0.018)；空白组大鼠TN和TS与CEP退变模型组比较，组间差异均无统计学意义(TN：LSD-t=0.432，P=0.924；TS：LSD-t=1.887，P=0.084)。造模后8周，3组大鼠TN、TS比较，组间差异均具有统计学意义；病证结合模型组大鼠TN低于空白组和CEP退变模型组(LSD-t=6.854,P=0.000；LSD-t=5.750，P=0.000)，TS高于空白组和CEP退变模型组(LSD-t=3.623，P=0.003；LSD-t=3.106，P=0.009)；空白组大鼠TN和TS与CEP退变模型组比较，组间差异均无统计学意义(TN：LSD-t=1.104，P=0.291；TS：LSD-t=0.518，P=0.614)。造模后4周、8周，3组大鼠TT比较，组间差异均无统计学意义。见表5。

表5 3组大鼠尾椎骨微结构指标

3.3 椎间盘CEP退变模型鉴定结果

3.3.1椎间盘CEP组织形态 造模后4周、8周，空白组软骨细胞分布均匀，潮线清晰，染色均匀；CEP退变模型组软骨细胞排列不规则，有少量簇聚软骨细胞，潮线不清；病证结合模型组软骨细胞排列紊乱、簇聚，软骨钙化层增厚，潮线模糊，染色不均匀；CEP退变模型组和病证结合模型组大鼠尾椎CEP均逐渐出现退变，病证结合模型组退变更明显(图3、图4)。

图4 造模后8周3组大鼠软骨终板组织形态(HE染色 ×50)表6 3组大鼠椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因表达量

图3 造模后4周3组大鼠软骨终板组织形态(HE染色 ×50)

3.3.2椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和ADAMTS-5基因的表达 造模后4周、8周，3组大鼠椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖基因表达量比较，组间差异均有统计学意义；空白组大鼠聚集蛋白聚糖基因表达量高于CEP退变模型组和病证结合模型组(造模后4周：LSD-t=4.045，P=0.002；LSD-t=6.815，P=0.000。造模后8周：LSD-t=4.329，P=0.001； LSD-t=6.774，P=0.000)，CEP退变模型组大鼠聚集蛋白聚糖基因表达量高于病证结合模型组(造模后4周：LSD-t=2.770，P=0.017。造模后8周：LSD-t=2.445，P=0.031)。造模后4周、8周，3组大鼠椎间盘CEP组织ADAMTS-5基因表达量比较，组间差异均有统计学意义；空白组大鼠ADAMTS-5基因表达量低于CEP退变模型组与病证结合模型组大鼠(造模后4周：LSD-t=3.543，P=0.004；LSD-t=11.104，P=0.000。造模后8周：LSD-t=6.702，P=0.000；LSD-t=14.821，P=0.000)，CEP退变模型组大鼠ADAMTS-5基因表达量低于病证结合模型组(造模后4周：LSD-t=7.562，P=0.000；造模后8周：LSD-t=8.119，P=0.000)。见表6。

4 讨 论

目前，中医药动物模型在中医药研究领域中得到了广泛应用[7]，且在中医药理论指导下构建的病证结合模型已成为当前研究中医药动物模型的发展趋势[8-9]。本研究通过去除大鼠卵巢的方法构建肾虚型疾病动物模型，在此基础上通过阻断CEP的营养供应途径模拟人类椎间盘CEP退变模型，试图构建肾虚型CEP退变病证结合模型。该模型的构建可进一步为研究椎间盘CEP退变发生的病理变化过程、中医药干预治疗以及预防提供一个科学的实验载体。

中医学认为肾为先天之本，藏精气，主骨、生髓、化血，主人体生长发育、生殖和调节机体代谢，为正气之根[10]，与现代医学的神经、内分泌、免疫、生殖、造血等多个系统有密切的关系[11-13]。已有研究表明，肾虚可导致下丘脑-垂体-性腺轴各环节功能存在不同程度的紊乱[14-15]。有学者已成功建立了肾虚型疾病动物模型，并把动物的行为学改变作为判别肾虚证模型构建成功的指标之一[16-17]。《素问·宣明五气》曰：“肾主骨生髓”“其充在肾”，即肾精充足，骨髓生化有源，则骨骼得到骨髓的充养而坚固有力[18]。若肾精虚少，骨髄化源不足，则不能滋养骨骼，易出现骨骼脆弱，导致骨质疏松等疾病的发生[19-20]。因此，本研究把骨骼的荣枯，即骨质疏松作为判定肾虚证的指标之一。本研究结果显示，造模后病证结合模型组大鼠逐渐表现出毛发枯槁易脱落、精神倦怠、两眼无神等与人类类似的肾虚证表现，且骨密度显著降低，骨微结构也发生了相应变化。这提示肾虚造模(去卵巢)大鼠出现了肾精亏虚，致使骨髓生化无源，骨骼不能得到充养，进而出现骨枯(骨质疏松)，说明肾虚型模型构建成功。

在本研究中，应用无水酒精注射阻断大鼠CEP营养供应后，组织病理学提示CEP组织逐渐出现退变表现，表现为软骨细胞排列不规则，软骨细胞簇聚，潮线模糊，染色不均，CEP钙化和骨化，软骨下骨骨板增厚等，提示CEP退变模型构建成功，这与袁维等[21]的研究结果类似。此外，我们研究也发现，病证结合模型组较CEP退变模型组，椎间盘CEP组织退变程度更重，提示肾虚可以加速CEP退变，进一步印证了“肾主骨生髓”的理论。此外，有学者研究认为，骨密度与IDD程度呈负相关，即骨密度越低，IDD程度越重[22]；其可能的发生机制为：骨密度降低，骨骼强度下降，引起骨性终板或椎体发生微小骨折，导致椎间盘营养供应破坏，从而影响椎间盘的代谢和血液循环，进而导致IDD[23]。

在造成软骨退变与破坏的众多影响因素中，基质降解酶活性增高是最主要和最直接的原因之一。聚集蛋白聚糖的降解被认为是软骨退变的重要指标[24-26]。ADAMTS-5是目前公认的最重要的聚蛋白聚糖酶之一，在降解软骨聚集蛋白聚糖的过程中起重要作用[27]。本研究采用无水酒精注射阻断CEP营养供应后，大鼠CEP组织中聚集蛋白聚糖基因表达量明显下降，而ADAMTS-5基因表达量明显上升，提示CEP细胞外基质出现了降解，从而导致CEP组织发生退变。此外，本研究结果显示，造模后病证结合模型组CEP组织中聚集蛋白聚糖基因表达量低于CEP退变模型组，而ADAMTS-5基因表达量高于CEP退变模型组，说明联合应用去卵巢法(肾虚)可进一步促进CEP退变。

本研究结果显示，切除双侧卵巢结合阻断CEP营养供应法是构建大鼠肾虚型椎间盘CEP退变病证结合模型的一种可行方法。