麦角甾醇在猴头菌种质评价中的应用研究初探

蒋 俊 宋小亚 刘 昆 路新彦

麦角甾醇在猴头菌种质评价中的应用研究初探

蒋 俊 宋小亚*刘 昆 路新彦

（丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000）

应用HPLC法对23份猴头菌种质的麦角甾醇进行测定分析的结果，麦角甾醇含量总体以平均值为中心呈正态分布，栽培种质、杂交选育种质、野生种质组内与组间有明显差异；分析液相图谱发现，不同种质甲醇提取物液相图谱的峰数存在明显差异，在一定程度上反映出种质差异性。应用HPLC法对麦角甾醇进行测定分析，适用于猴头菌种质资源的初步评价研究。

代谢产物；定向育种；甲醇提取物；麦角甾醇

猴头菌（）是我国传统的食药用真菌，富含多糖类、甾醇类、萜类、酚类、生物碱类等多种生物活性成分，具有很高的食用和药用价值。研究表明，甾醇类物质对胃黏膜有保护作用，猴头菌类药物产品对胃炎的良好疗效可能与猴头菌中的甾醇类物质有关[1-2]。麦角甾醇是真菌类的特征性成分，是细胞膜的重要组分，它在确保膜结构的完整性、细胞活力和物质运输等方面起着重要作用[3]。麦角甾醇是猴头菌的重要成分，目前研究多集中在子实体、菌丝体、提取物及药品中麦角甾醇含量测定方面，而对不同来源的种质资源特别是野生种质综合分析评价的研究较少[4-9]。

种质是培育优良作物品种的物质基础，种质评价可为种质的合理开发利用及育种亲本选择提供科学依据。目前食用菌种质评价主要围绕农艺性状、遗传多样性等进行，对活性成分等品质性状关注较少[10, 11]。猴头菌是食药兼用菌，富含多种生物活性成分，对活性成分的测定分析应是种质评价的重要内容。本文旨在以活性成分麦角甾醇为目标，对不同来源的猴头菌种质资源进行初步研究评价，以期为深入研究和合理开发利用相关种质提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的23份猴头菌种质，含栽培种质3份、自育种质2份、野生种质18份（表1）。

23份种质于2018年底统一制种、接菌包。栽培袋规格为17×33（cm），培养料配方为棉籽壳∶麸皮∶石膏=93∶6∶1，含水量55%～60%，pH自然。随机抽取6袋在本单位生产基地菇棚内进行出菇管理，子实体成熟后采收，采收期为2019年3月中旬至6月中旬。采收后的子实体置于电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干；相同种质采收期内的干菇样品合并混匀，置于中药粉碎机粉碎，过30目筛，备用。

1.2 仪器设备与试剂

仪器：Agilent1260 高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器，柱温箱，VWD 检测器，Agilent 化学工作站）；万分之一天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）；超声清洗仪（昆山舒美超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）。

药剂：甲醇（色谱纯），购自北京百灵威科技有限公司；麦角甾醇标准品（纯度≥98%），购自合肥博美生物科技有限责任公司。

1.3 试验方法

（1）麦角甾醇标准品制备。准确称取10 mg麦角甾醇标准品，用甲醇溶解后定容至100 mL，配成100 μg/mL麦角甾醇标准品溶液，稀释至20 μg/mL备用。

表1 种质资源来源及收集年份

（2）供试样品甲醇提取物溶液制备。精确称量0.1 g食用菌干粉于25 mL容量瓶中，每个样品3次重复，加入20 mL甲醇超声1 h，用甲醇定容至刻度，取上清用0.22 μm有机微孔滤膜过滤后采用HPLC测定麦角甾醇含量[8]。

图1 标准品的液相图谱

图2 样品的液相图谱

（3）色谱条件。色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（100 mm × 4. 6 mm，3.5 μm）；流动相：100%甲醇溶液；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：282 nm；进样体积：20 μL[12]。

（4）方法学考察。为验证该色谱条件是否适合猴头菌样品麦角甾醇含量的测定，进行专属性、精密度、重复性、稳定性、加样回收率、线性关系考察等试验。

专属性试验：取猴头菇样品（h73），按“1.3（2）”项制备猴头菇甲醇提取物，按“1.3（3）”项分析测定。由图1、图2可知，在样品的麦角甾醇色谱峰出峰位置处无干扰，表明猴头菇甲醇提取物麦角甾醇的检测方法专属性良好。

精密度试验：按“1.3（2）”项制备标准品溶液，按“1.3（3）”项色谱条件连续进样6次，考察样品中麦角甾醇的相对保留时间和相对峰面积。麦角甾醇相对保留时间RSD为0.34%，麦角甾醇峰面积比RSD为0.13%，表明精密度良好。

重复性试验：取猴头菇样品（h73）6 份，按 “1.3（2）”项制备猴头菇甲醇提取物，按“1.3（3）”项下色谱条件测定。考察样品中麦角甾醇的相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间RSD小于0.51%，峰面积比RSD小于1.12%，表明方法重复性良好。

表2 加样回收率试验

稳定性试验：取猴头菇样品（h73），按 “1.3（2）”项制备备猴头菇甲醇提取物，按“1.3（3）”项下色谱条件在0、2、4、8、12 h测定麦角甾醇的含量。考察不同进样时间，样品中麦角甾醇的相对保留时间和相对峰面积，结果显示12 h 内麦角甾醇的相对保留时间 RSD为 1.18%，峰面积比 RSD 为0.31%，表明猴头菇甲醇提取物供试品溶液在12 h内稳定。

加样回收率试验：取已知含量猴头菇粉末0.1000 g，共6 份，分别加入麦角甾醇对照品适量，依照“1.3（2）”项方法制备供试品溶液，并按“1.3（3）”项下色谱条件进行测定，计算所得回收率分别为96.97%～101.65%，平均回收率为99.50%，麦角甾醇峰的相对保留时间RSD为0.21%，峰面积比RSD值为1.94%（表2）。表明准确度良好，符合试验要求。

表3 各种质的麦角甾醇含量测定结果

图3 各种质麦角甾醇含量分布图

线性关系考察：取“1.3（2）”项下对照品储备液，以8 μL、16 μL、24 μL、32 μL、40 μL，按“1.3（3）”项下色谱条件进行分析，以测得的峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。=21.706－0.0867，R=1。由结果可知，麦角甾醇在8～40 μg/L范围内呈良好线性关系。

系统的方法学考察结果表明，所采用的麦角甾醇检测方法精密度高、重复性好；样品溶液在12 h内，稳定性好；在实验浓度范围内，峰面积与麦角甾醇的浓度呈现较好的线性关系。表明该方法适用于猴头菌中麦角甾醇的测定。

2 结果与分析

2.1 各种质麦角甾醇的含量

从测定结果（表3）可以看出，部分种质间的麦角甾醇含量差异明显。23份猴头菌种质的麦角甾醇含量在2.23±0.02‰～4.39±0.02‰之间，平均值为3.26‰，含量最高的WH1比最低的WH3高96.8%。由含量分布图（图3）可知，猴头菌种质麦角甾醇含量以平均值为中心，基本呈正态分布，大部分种质麦角甾醇含量在2.4‰～4.2‰，占比达87.0%；高于4.2‰的种质有1个，占比4.3%。

栽培种质、杂交菌株、野生种质组内与组间有明显差异。栽培种质麦角甾醇含量平均值为2.93‰，其中，D的含量较高，为3.53±0.01‰，较平均值高20.5%；A的含量较低，为2.56±0.01‰。杂交菌株h73、h92的麦角甾醇含量分别为3.84±0.03‰和3.17±0.05‰，平均值为3.51‰，h73较平均值高9.4%。野生种质麦角甾醇含量平均值为3.28‰，其中，含量最高的WH1为4.39±0.02‰，比平均值高33.8%；WH3含量最低，仅为2.23±0.02‰。

从各组麦角甾醇含量的平均值看，杂交菌株（由高麦角甾醇含量的亲本种质杂交选育而来，未同批次栽培，故本研究未一起分析）高于野生种质，野生种质高于常规栽培种质；野生种质的含量分布范围较广，高麦角甾醇含量的野生种质有望定向驯化栽培或作为育种亲本使用。

图4 猴头菌种质的液相图谱

2.2 种质液相图谱的差异分析

图4为种质A、h73、D的液相图谱，从中可以看出，采用该测定方法，猴头菌种质麦角甾醇峰的特异性良好、峰形锐、对称性好，具有较好的分离度。

猴头菌种质甲醇提取物的液相图谱在出峰位置、峰数量、峰面积上都呈现出明显的差异性，表明种质的化学成分存在较大差异。化学成分为生物活性的物质基础，种质的生物活性可能也存在较大的差异，液相色谱图的上述差异可初步反映出种质的差异性。

3 讨 论

本试验结果表明，不同来源的猴头菌种质的麦角甾醇含量不一，含量高低与其来源之间没有相关性。栽培和野生种质中的麦角甾醇含量均有高有低，相同地域来源的野生种质中麦角甾醇含量也各不相同。由此说明，猴头菌种质对麦角甾醇含量的影响较大，这与王金艳等对不同原料来源灵芝孢子粉的研究结论相似[13]。

麦角甾醇为生物生长过程中的次级代谢产物，其合成和积累不但受遗传控制，还受培养基质、生长发育阶段、环境条件等因素的影响。为客观反映不同猴头菌种质的麦角甾醇的含量水平，本文所用研究材料为相同生产管理条件下的全周期子实体样本，采收标准一致，所测含量为采收期内所有子实体中麦角甾醇含量的平均值。

应用HPLC法对不同来源猴头菌种质的甲醇提取物进行测定分析，可以准确、灵敏、快速地测定不同种质的麦角甾醇含量，并在一定程度上反映子实体中化学成分的差异，说明该方法适用于猴头菌种质的初步评价，对育种亲本选择和活性物质筛选具有指导意义。现代药学研究表明，许多植物药的药理作用与其所含的次生代谢物质有关，药物的质量取决于次生代谢产物的积累，保持其药材质量及有效性的基础是植物的次生代谢[14]。麦角甾醇是猴头菌重要的次生代谢产物，具有良好的生理活性。因此，对不同来源猴头菌种质的麦角甾醇含量进行测定分析，对于开展种质评价、定向驯化栽培及育种亲本选择具有重要意义。

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Preliminary application research of ergosterol in germplasm evaluation of

Jiang Jun Song Xiaoya*Liu Kun Lu Xinyan

（Lishui Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Lishui, Zhejiang 323000, China）

The contents of ergosterol in 23germplasm were determined by HPLC. The results showed that ergosterol content in different germplasm was significantly different, ergosterol content was normally distributed at the center of average value, and there were significant differences between germplasm groups in cultivated germplasm, hybridized germplasm and wild germplasm. Analysis of liquid chromatogram showed that there were obvious differences in the number of peak of methanol extract from different germplasm, which could reflect the difference of germplasm to some extent. The germplasm ofcould be evaluated rapidly by HPLC of ergosterol determination.

metabolites; oriented breeding; methanol extraction; ergosterol

S646

B

2095-0934（2021）04-323-05

丽水市高层次人才资助项目2017RC06；丽水市科技计划项目2014XPZ07

蒋俊（1986—），男，助理研究员，从事食药用菌栽培及其生物活性研究。E-mail：jiangj-1@163.com。

宋小亚，女，高级农艺师，主要从事食药用菌育种研究。E-mail：lssyj323000@163.com。