以白藜芦醇为结构单元的丹酚酸A类似物的合成及其体外抗氧化作用测定

陈妙佳， 马思明， 李 洋， 贺 芬， 彭俊梅， 唐国涛， 曹 轩

(南华大学药物药理研究所 湖南省分子靶标新药研究协同创新中心，湖南省衡阳市421001)

丹酚酸A是从丹参中分离得到的酚酸类化合物，具有很强的抗氧化活性[1-2]。研究表明，丹酚酸A有望成为一种新的心脑血管保护剂[3-4]。但是丹酚酸A具备双键、酯基、手性等复杂的结构，合成难度很大。由于丹酚酸A在丹参中的含量很小，如果直接从丹参中提取和纯化，步骤复杂且产率很低。因此，丹酚酸A的原料来源有限且价格昂贵，限制了其进一步研究[5-6]。因此合成丹酚酸A的结构类似物对研究丹酚酸A类化合物的结构以及药理活性具备重要的理论价值[7-8]。

本文拟设计全新的丹酚酸A的类似物，结构改造如下：①采用碳氮双键或碳氮单键替代丹酚酸A中的酯键，提高化合物的稳定性；②将其羧酸基团酯化，提高其脂溶性；③用廉价易得的卡比多巴取代丹酚酸A中的酚酸类结构片段；④用抗氧化能力更强的白藜芦醇为结构单元取代丹酚酸A结构中的二苯乙烯片段[9-10]。通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)体外模型法对所合成的丹酚酸A类似物进行体外抗氧化活性的测定，为丹酚酸A类似物的研究提供合成思路和活性研究基础。

1 材料和方法1.1 试剂与检测

卡比多巴、白藜芦醇及硼氢化钠均购自阿拉丁试剂有限公司；DPPH购自百灵威试剂有限公司；其他有机溶剂均购自湖南汇虹试剂有限公司。除三氯氧磷在使用前进行重蒸外，其他试剂一般并未做进一步处理。1HNMR由湖南大学化学传感国家重点实验室检测和提供。

1.2 白藜芦醛的合成

将3.0 g白藜芦醇加入三口烧瓶中，加入15 mL N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)，磁力搅拌使其溶解。另加30 mL DMF于烧杯中，在通风橱内缓慢滴入8 mL三氯氧磷(phosphorus oxychloride，POCl3)，小心搅拌，溶液由无色变成淡棕色。室温下上述反应液放置于恒压滴液漏斗中趁热滴入三口烧瓶中，搅拌2～3 h直至整个溶液变成凝胶状固体。冰浴下，将120 mL水逐滴加入三口烧瓶，必要时采用机械搅拌过夜。有大量黄色固体析出，产物收率92%。

1.3 卡比多巴的酯化

将4.0 g卡比多巴加入150 mL三口烧瓶中。加入50 mL甲醇溶液。通入干燥浓盐酸并加热搅拌，回流2.5～6.0 h。同时用薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)确定反应终点(水∶丙酮=1∶20)。反应结束后将液体倒进梨形烧瓶，减压去除产物中的HCl气体和溶剂，得到卡比多巴酯化粗产物。

1.4 丹酚酸A类似物a、b、c的合成

在烧瓶中加入500 mg白藜芦醛和50 mL甲醇溶液，加入1 mL卡比多巴酯化产物，于65 ℃回流3 h。同时用监测反应(乙酸乙酯∶石油醚=1∶3)。将溶剂蒸发后，硅胶柱纯化产物(洗脱剂甲醇∶二氯甲烷=1∶30)，得到丹酚酸A类似物a、b、c。

产物a熔点：134～135 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.50(s,1H),7.51-7.41(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.82(dd,J=8.0 Hz,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.68-6.60(m,1H),6.57(d,J=2.4 Hz,1H),6.52(dd,J=8.0 Hz,1H),6.26(d,J=2.4 Hz,1H),3.72(d,J=2.4 Hz,3H),3.01(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(s,3H)，产物收率35.8%。

产物b熔点：134～136 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)：δ8.52(d,J=4.0 Hz,1H),7.51-7.42(m,2H),7.32(d,J=16.0 Hz,1H),6.91(d,J=16.0 Hz,1H),6.88-6.79(m,2H),6.74-6.69(m,1H),6.67(d,J=2.4 Hz,1H),6.58(d,J=2.4 Hz,1H),6.54(dd,J=8.0 Hz,1H),6.27(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.04-2.92(m,2H),1.44(s,3H),1.24(dd,J=8.0 Hz,3H)，产物收率18.0%。

产物c熔点：136～138 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.50-7.42(m,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.86-6.77(m,2H),6.71(d,J=8.0 Hz,1H),6.60-6.49(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),3.05-2.88(m,2H),1.42(s,3H),1.28-1.21(m,3H),1.18(d,J=8.0 Hz,3H)，产物收率13.8%。

1.5 丹酚酸A类似物d、e、f的合成

在烧瓶中加入甲醇20 mL和8.8 mg丹酚酸A类似物a～c，再加入约3倍的硼氢化钠，搅拌大约20 min。加水20 mL并调节pH为微酸性(约为6)后用乙酸乙酯(30 mL×3)萃取。用无水硫酸钠干燥,旋干所得液体。得到丹酚酸A类似物d、e、f。

产物d熔点：170～173 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.48(s,1H),7.45(d,J=8.0 Hz,2H),7.30(d,J=16.0 Hz,1H),6.89(d,J=16.0 Hz,1H),6.81(d,J=8.0 Hz,3H),6.24(s,1H),3.71(d,J=4.0 Hz,3H),2.98(dd,J=16.0 Hz,2H),1.44(d,J=12.0 Hz,3H)，产物收率92%。

产物e熔点：172～174 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.51(s,1H),7.46(d,J=8.0 Hz,2H),7.31(d,J=16.0 Hz,1H),6.90(d,J=16.0 Hz,1H),6.87-6.75(m,3H),6.75-6.62(m,2H),6.61-6.44(m,2H),6.25(d,J=2.4 Hz,1H),4.18(q,J=8.0 Hz,2H),3.35(p,J=2.4 Hz,3H),2.98(q,J=12.0 Hz,2H),1.43(s,3H)，产物收率89%。

产物f熔点：175～178 ℃，1HNMR(400 MHz,Methanol-d4)δ8.56(d,J=4.0 Hz,1H),7.51(d,J=8.0 Hz,2H),7.37(d,J=16.0 Hz,1H),6.96(d,J=16.0 Hz,1H),6.88(d,J=8.0 Hz,3H),6.75(dt,J=8.0 Hz,2H),6.6-6.53(m,3H),6.31(d,J=2.4 Hz,1H),4.19(q,J=8.0 Hz,1H),3.01(q,J=12.0 Hz,2H),2.10(d,J=4.0 Hz,1H),1.46(d,J=4.0 Hz,3H),1.29(d,J=8.0 Hz,3H),1.23(d,J=8.0 Hz,3H)，产物收率90%。

1.6 DPPH法测定抗氧化活性

DPPH储备液的制备：称取5 mg DPPH试剂，加少量的无水乙醇溶解，得到紫色液体，并且将其定量转移至10 mL的容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线；然后用移液管吸取2 mL试液置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线，摇匀得到DPPH储备液，放到4 ℃冰箱中冷藏备用。待测样品的制备：称取1 mg丹酚酸A类似物a～f，用少量的无水乙醇使其溶解，并定量转移至10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度线。随后用移液管在10 mL容量瓶中准确吸取1 mL试液置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，得到待测样品a。再用上述方法分别制得待测样品b～f。对照品的制备：用移液管吸取4 mL DPPH标准液放入10 mL的容量瓶中，随后加乙醇定容至刻度线。

1.7 DPPH清除率的测定

在10 mL容量瓶中，先加入4.0 mL的DPPH溶液，随后加入4.0 mL的待测试液，再用无水乙醇定容至刻度线，摇匀。立即用待测液将1 cm比色皿润洗，之后在517 nm波长处测其光密度值(OD1)，再在室温避光保存30 min后测光密度值(OD2)。对照试验为只加4.0 mL DPPH的乙醇溶液，测其光密度值(OD3)。同理，用上述方法分别测定其他待测样品的光密度值(OD)。重复测定3次，取其平均值作为最后结果。将所测得的清除率与维生素C标准品的清除率比较。按下式计算自由基清除率K(%)=(实验组OD1-实验组OD2)/空白组OD3×100%。

2 结 果

2.1 丹酚酸A类似物的合成

丹酚酸A类似物的合成如图1所示。在白藜芦醇的结构中采用Vilsmeier-Haack反应引入醛基，再将卡比多巴的羧酸基团酯化。最后，将酯化产物与白藜芦醛进行醛胺缩合即得丹酚酸A类似物a、b、c。考虑到碳氮双键有可能不稳定，将碳氮双键还原为碳氮单键，最终获得丹酚酸A类似物d、e、f。

图1 化合物a-f的合成路线

2.2 DPPH法测定丹酚酸A类似物的抗氧化活性

丹酚酸A类似物d、e、f均表现出了较强的抗氧化活性，而丹酚酸A类似物a、b、c抗氧化活性很差(图2)，可能是由于在水中容易分解导致的。经过硼氢化钠的还原后，碳氮双键转变为碳氮单键，提高了化合物的稳定性，其抗氧化活性相差4倍以上。此外，丹酚酸A类似物d、e、f的抗氧化活性明显强于对照品抗坏血酸以及丹酚酸A。

图2 DPPH法测定丹酚酸A类似物的自由基清除率

3 讨 论

丹酚酸A的结构可视为酚酸类化合物与二苯乙烯类化合物两个结构单元的酯化反应产物。由于丹酚酸A的结构中具备不稳定的酯键，在体内容易水解开环，而且由于其中含有羧酸基团，使得其分子的穿膜能力大大下降，使得其很难进入细胞内而发挥其药理作用。如果采用酰肼键替代丹酚酸A中的酯键，可进一步稳定其结构，此外若将其羧酸基团酯化，可提高其脂溶性，增加其穿膜能力，增强其药效。丹酚酸A的结构中的二苯乙烯结构中为茋四酚结构，具有4个羟基，从而具备较好的清除自由基能力。但类似结构的白藜芦醇具备茋三酚结构，其抗氧化能力更强。白藜芦醇是一种天然多酚类物质，生理活性很多[11-13]，其抗氧化能力在多酚类中是较强的，可以用来预防冠心病，保护心血管[14-15]。研究表明，其抗氧化能力的重要基团是4′-羟基，使得其抗心血管氧化能力提升，类似的结构还有紫檀茋等，因此如果采用茋三酚的结构片段替代丹酚酸A结构片段中的茋四酚结构，有可能获得更强抗氧化活性的丹酚酸A类似物[16]。

经过Vilsemier反应在其芳环上引入醛基，是目前在芳环上引入甲酰基的常用方法。其反应机理为DMF与三氯氧磷反应，产生亲电的N+，随后N+进攻白藜芦醇中含有两个羟基的苯环的邻位，即苯环上的2位碳，经水解、氧化得到目标产物白藜芦醛。实验采用DMF作溶剂的情况下，只需常温就可以反应，不但产物收率较高，而且直接加水后产物析出呈现亮黄色，一般无需纯化即可投入下一步使用。

卡比多巴的酯化过程需要在反应过程中通入浓盐酸来催化反应，因为L-甲基多巴不溶于甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇，也有采用惰性溶剂中添加催化量的SOCl2等卤化剂来催化反应，但实验中发现添加SOCl2反应时间需要1～2天，反应时间长。本实验中采用通入干燥的HCl气体回流反应，3～5 h就可反应完全。

醛胺缩合反应可直接在醇溶液条件下加热回流3 h。由于产物a、b、c的结构中碳氮双键只连有一端芳香环，使得整个的N上负电共轭较差，从而导致缩合产物很容易水解，在柱层析时大部分会分解。在后续的实验中，直接在反应后体系中加入硼氢化钠进行还原，之后再进行柱层析，产物收率显著提高。

综上，本文所设计的丹酚酸A类似物d、e、f均具有很强的抗氧化活性，强于对照品抗坏血酸以及丹酚酸A。推测活性提升极有可能是由于采用了白藜芦醇茋三酚的结构片段替代丹酚酸A结构片段中的茋四酚结构。这说明所设计的丹酚酸A类似物具备进一步研究和开发的潜力，为丹酚酸类化合物的结构设计与药理作用提供基础。