缺氧通过HIF-1α/PCSK9信号途径诱导神经细胞凋亡

刘录山， 邓懿铭， 李 清

(1.南华大学心血管疾病研究所 动脉硬化学湖南省重点实验室 湖南省动脉硬化性疾病国际科技合作与创新联合实验室，湖南省衡阳市 421001；2.湖南环境生物职业技术学院病理学教研室，湖南省衡阳市 421001)

缺血缺氧性脑损伤通常由脑组织出现急性或慢性的局部或完全缺氧所导致，临床上以新生儿窒息引起的脑损伤多见[1]，是引起神经系统损伤的主要原因，在此过程中神经细胞凋亡起着重要角色[2]。

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一类真核细胞转录因子，在细胞处于低氧状态时其表达水平升高以应激性地对抗内环境改变[3-4]。研究表明前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)与神经细胞凋亡存在相关性[5]。本课题研究缺氧是否通过调节HIF-1α表达上调PCSK9水平引起神经细胞凋亡，旨在为缺血缺氧性损伤的防治提供潜在的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

PC12细胞购自中科院上海细胞库；氯化钴(CoCl2)购于美国西格玛公司；DMEM培养基购于美国Hyclone公司；ECL化学发光检测试剂盒购自湖南艾佳生物科技公司；胎牛血清购自天津市灏洋生物制品公司；Hoechst 33258染色剂购自江苏碧云天生物有限公司；PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9、β-actin兔抗人多克隆抗体均购自Proteintech公司；Lip 2000转染试剂、台盼蓝染色液购自北京索莱宝公司；缺氧诱导因子抑制剂利非西呱(YC-1)、缺氧诱导因子激动剂二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)购自美国Selleck公司；PCSK9小干扰RNA(PCSK9 small interfering RNA,PCSK9 siRNA)购自吉凯基因。倒置光学显微镜购自日本Olympus公司；倒置荧光显微镜购自日本尼康公司；化学发光成像系统购自上海天能公司；凝胶电泳系统购自美国BIO-RAD公司；Aria Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及分组

PC12细胞于含有10%胎牛血清及1%青/链霉素的DMEM培养基中，37 ℃，5%CO2条件下培养。2～3天定期更换培养基，融合度70%～80%进行传代。使用不同浓度CoCl2(0、125、250、500 μmol/L)孵育PC12细胞24 h并观察CoCl2对PC12细胞的影响；使用不同浓度DMOG(0、250、500、1 000 μmol/L)与250 μmol/L CoCl2共孵育PC12细胞24 h并观察DMOG对PC12细胞的影响；使用不同浓度YC-1(0、1、10、50 μmol/L)与250 μmol/L CoCl2共孵育PC12细胞24 h并观察YC-1对PC12细胞的影响。细胞转染实验中，无义RNA组为siCtrl+250 μmol/L CoCl2，PCSK9 siRNA组为siPCSK9+250 μmol/L CoCl2。

1.3 蛋白印迹分析

对各个分组中的PC12细胞分别进行处理后提取总蛋白，在培养瓶中加入RIPA裂解液充分作用，采用BCA法进行蛋白含量测定，取含有30 μg蛋白的样本进行蛋白印迹法检测，电泳后电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下作用2 h，4 ℃孵育1∶1 000稀释的PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9一抗或1∶5 000稀释的β-actin一抗过夜，洗膜3次后室温孵育1∶2 000稀释的二抗1 h，ECL化学发光法得到条带并计算蛋白相对表达水平。

1.4 Hoechst 33258核染色检测细胞凋亡

PC12细胞分别进行处理后，以1×PBS润洗细胞3次，4%多聚甲醛固定30 min，蒸馏水润洗3次，10 min/次，每孔加入Hoechst 33258染液于避光条件下作用25 min，蒸馏水润洗3次，10 min/次。甘油封片，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色

处理各组PC12细胞后，0.25%的胰酶1 mL消化适度后终止，吹打混匀后离心1 000 r/min 10 min，收集细胞并以1×Binding Buffer重悬，离心2 000 r/min 5 min，洗涤。1×Binding Buffer再次重悬，离心2 000 r/min 5 min后再次加入缓冲液重悬混匀后继续加5 μL Annexin V-FITC进行染色，于常温下孵育15 min后再补入5 μL PI与200 μL缓冲液后使用流式细胞仪进行检测并计数。

1.6 细胞转染

PC12细胞接种于24孔板中待融合度达30%～50%后转染，通过脂质体Lip2000使无义siRNA与PCSK9 siRNA分别转染PC12细胞，并分别标记为无义RNA组与PCSK9 siRNA组，37 ℃培养箱中转染48 h后检测转染效率。PCSK9 siRNA正义链为5′-GGAGGAUAGCCUGGUUGAUdTdT-3′，反义链为3′-d Td TCCUCCUAUCGGACCAACUA-5′；阴性对照siRNA由吉凯基因公司提供。

1.7 统计分析

2 结 果

2.1 CoCl2对PC12细胞中HIF-1α和PCSK9表达的影响

与0 μmol/L CoCl2组比较，其他CoCl2处理组HIF-1α和PCSK9表达升高且随CoCl2浓度的增加呈递增趋势(图1)。用250 μmol/L CoCl2处理PC12细胞0、6、12、24 h，随着处理时间延长，HIF-1α和PCSK9表达呈递增趋势(图1)。

图1 不同浓度或不同时间CoCl2处理PC12细胞对HIF-1α及PCSK9表达影响

2.2 CoCl2呈浓度依赖性促进PC12细胞的凋亡

结果显示随着CoCl2浓度的增高，与核染剂Hoechst33258结合而呈致密浓染或呈碎块状致密浓染区域逐渐增多；流式细胞术检测显示凋亡率也随之递增(图2)。

图2 CoCl2呈浓度依赖性促进PC12细胞的凋亡

2.3 DMOG对PC12细胞HIF-1α、PCSK9表达以及凋亡的影响

各浓度组DMOG均能在CoCl2诱导的低氧状态下上调PC12细胞中HIF-1α、PCSK9的表达并下调Caspase-3、Caspase-9的表达(图3)。Hoechst33258染色结果及流式细胞术检测结果显示，DMOG呈浓度依赖性抑制CoCl2导致的PC12凋亡(图4)。

图3 DMOG对PC12细胞HIF-1α和PCSK9表达以及凋亡的影响

图4 DMOG呈浓度依赖性降低PC12细胞凋亡水平

2.4 YC-1对PC12细胞PCSK9、HIF-1α表达以及PC12细胞凋亡的影响

各浓度组YC-1均能在CoCl2诱导的低氧状态下下调PC12细胞中PCSK9、HIF-1α的表达并上调Caspase-3、Caspase-9的表达且表现出浓度依赖性(图5)。Hoechst33258染色结果及流式细胞术检测结果显示，YC-1呈浓度依赖性促进PC12凋亡(图6)。

图5 不同浓度HIF-1α抑制剂YC-1对PC12细胞HIF-1α、PCSK9及凋亡相关蛋白表达的影响

图6 YC-1呈浓度依赖性增加PC12细胞凋亡水平

2.5 PCSK9 siRNA转染结果鉴定

与空白组及无义RNA组比较，siPCSK9组基因表达显著下调，证明转染效率较高，转染成功(图7)。

图7 PCSK9 siRNA有效降低了PC12细胞中PCSK9表达(n=3)

2.6 PCSK9 siRNA转染对PC12细胞凋亡的影响

为进一步探究PCSK9在CoCl2诱导的PC12细胞凋亡中的作用，进行如下分组：空白对照组；250 μmol/L CoCl2组；250 μmol/L CoCl2+无义RNA组；250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA组。Western blot检测显示，与无义RNA组比较，250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA组PCSK9表达降低且Caspase-3、Caspase-9表达均减少(图8)。Hoechst33258荧光染色及流式细胞术检测结果显示，干扰PCSK9表达可降低CoCl2导致的PC12凋亡(图9)。

图8 PCSK9 siRNA对CoCl2诱导的PC12细胞中PCSK9及凋亡相关蛋白表达的影响

图9 PCSK9 siRNA下调PC12细胞凋亡水平

3 讨 论

心脑血管疾病等慢性病引起的慢性缺血缺氧仍是目前一大难题。课题组前期研究发现oxLDL促使PC12细胞凋亡是PCSK9通过Bcl-2/Bax-Caspase-9/3信号通路所诱导[6]，提示PCSK9具有促神经细胞凋亡的作用。

HIF-1是一类细胞缺氧相关转录因子，细胞低氧应激下其表达上调可激活多条相关通路，但其在缺氧损伤中的作用及机制仍具有争议性[7-8]，细胞种属特异性及浓度相关的双向性调节可能是其原因。

缺血缺氧性脑损伤发病机制复杂，氧化应激、谷氨酸兴奋性神经毒性、炎症、钙超载等都是其中可能的分子机制，而神经细胞凋亡或坏死是其最终结果[9]。细胞凋亡是一种多基因严格控制的细胞自主性、有序性的死亡，正常水平的凋亡在调节细胞周期、维持内环境稳态及个体发育中有着重要意义，而既往神经学研究显示神经细胞的加速凋亡是神经退行性变的重要原因。研究表明缺氧使神经细胞凋亡增加[10]，且缺氧能使神经细胞HIF-1α表达增加[8]。本研究中选用CoCl2作为细胞缺氧模拟剂对PC12进行缺氧干预[11]，进一步通过分级干预探究PCSK9与HIF-1α在神经细胞凋亡中的作用机制。结果表明：CoCl2处理下PC12细胞中PCSK9、HIF-1α以及细胞凋亡水平较对照组升高，PCSK9 siRNA转染后，CoCl2处理下PC12细胞凋亡水平较转染对照组下降，表明低氧状态下PC12细胞凋亡水平升高，而HIF-1α介导的PCSK9表达上调是其潜在的分子机制。

综上所述，CoCl2诱导的细胞缺氧状态能上调PC12细胞凋亡水平，HIF-1α介导的PCSK9表达上调是其潜在分子机制。这为缺血缺氧性脑损伤的防治提供了分子生物学依据，为缺血缺氧性脑损伤的靶向防治提供更多思路。