三种抗原修复法对牙-牙周免疫组化切片的影响

叶传进

（南京大学医学院附属口腔医院（南京市口腔医院） 口腔病理科，江苏 南京）

0 引言

研究牙周组织的生理、病理及病生理机制最常用的方法是免疫组化，牙周组织中硬组织钙含量较多，硬脆、易碎、难切；软组织则易受拉扯、挤压产生变形分离甚至脱落。因此牙-牙周组织切片的制作难度较大，且对免疫组化尤其是抗原修复和缓冲液长时间浸泡染色的过程中容易发生脱片现象。牙-牙周免疫组化染色切片的效果对实验结果影响较大，本研究即分析高压修复、酶修复、隔水热修复3种抗原修复方法对牙-牙周免疫组化切片染色的效果，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

压力锅；复合消化酶和兔抗鼠巨噬细胞单克隆抗体，免疫组化MaxVision检测试剂盒，DAB显色试剂盒；柠檬酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH值6.0）；PBS缓冲液（2000 mL/包、pH 值 7.2~7.4）。

取用颈椎脱位法致其死亡的成年健康雄性大鼠，取出大鼠上下颌骨磨牙区组织块，用10%中性甲醛液固定24 h，10% EDTA 脱钙3~4周，常规脱水，石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 组织切片处理

将组织蜡块于-20 ℃下冷冻2 min后取出，使用轮转切片机连续切2 μm一片的切片，将切片展开后再使用粘附载玻片捞片，为保证切片效果应确保每张切片在载玻片中心位置。将上述组织切片每组各捞20片一共3组，将水温调整至46 ℃后把切片摊开，使组织与载玻片平整粘附，然后于70 ℃烤片机上将切片与载玻片牢固结合，效果达到不出现重力移位现象即可将载玻片放入烘片机，温度调整为60 ℃，烘烤2 h。

1.2.2 切片脱蜡水化处理

将完成上述切片处理的切片放进通风橱中的二甲苯脱蜡剂中进行脱蜡处理3次，每次10 min，确保脱蜡干净后进行梯度水化，梯度水化为无水乙醇→95%乙醇→90%乙醇，每个梯度水化5 min。

1.2.3 抗原修复

1.2.3.1 高压法抗原修复

切片盒中倒入适量柠檬酸盐缓冲液，将组织切片插入切片盒，高压锅中水煮沸后将切片盒放入加热，设定电磁炉1000 W，待高压锅喷气后加阀1.5~2 min，后等待修复液自然冷却至室温。

1.2.3.2 酶消化法抗原修复

组织切片上滴加复合消化酶，将组织切片置入保湿盒，放置进温箱，温度调整至37 ℃，时间20 min。上述完成后将组织切片取出，用PBS缓冲液进行漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.3.3 隔水热法抗原修复

将组织切片置入有柠檬酸盐缓冲液的切片盒中，放入水浴锅中加热，待锅内水温达到92 ℃，维持并加热40 min，然后待缓冲液自然冷却至室温，用PBS缓冲液漂洗，5 min/次，漂洗3次。

1.2.4 组织切片染色

待上述3种修复完成后将免疫组化切片进行染色。具体为：将组织切片自PBS缓冲液中取出并甩干水分，放入DAB显色试剂盒，静置3 min待切片尽可能吸干显色液，然后将切片置入DAB清洗液中水洗，后滴加苏木素复染30 s。

1.2.5 脱水、透明、封片

脱水处理：95%乙醇脱水1 min→无水乙醇脱水1 min→无水乙醇脱水1 min；透明处理：将切片架放进二甲苯透明剂中透明，3 min/次，进行2次；封片标记处理：中性树胶滴入切片中封片，标记归类。

1.3 观察指标

脱片即组织切片与载玻片未牢固结合，与载玻片分离、脱落、悬浮等情况。对上述切片处理后的脱片情况进行归类如下：轻度脱片：切片脱离载玻片面积在10%以下；中度脱片：切片脱离载玻片面积在10%~80%；重度脱片：切片脱离载玻片面积超过80%。脱片率=（轻度脱片+中度脱片+重度脱片）/所有切片×100%。显效染色：切片染色均匀，能清除观察到研究组织；有效染色：切片染色比较均匀，可以观察到研究组织；无效染色：切片染色不均，无法有效观察到研究组织。染色率=（显效染色＋有效染色）/所有切片×100%。

综合考虑脱片率和染色率后对3种抗原修复法进行分析。

1.4 统计学分析

将数据纳入SPSS 22.0软件中分析，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种抗原修复中牙-牙周免疫组化切片的脱片率对比

酶消化修复的脱片率最低，隔水热修复次之，高压修复的脱片率最高，见下表1。

表1 3种抗原修复中牙-牙周免疫组化切片的脱片率对比（n, %）

2.2 3种抗原修复中牙-牙周免疫组化切片的染色率对比

高压修复的染色率最高，隔水热修复次之，酶修复的染色率最低，见下表2。

表2 3种抗原修复中牙-牙周免疫组化切片的染色率对比（n, %）

3 结论

免疫组化染色技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理。利用化学反应将显色剂标记于特异抗体上，借助显微镜对抗原抗体结合部位观察从而确定组织细胞结构的一门新技术[1]。免疫组化的染色质量受整个试验过程多方面因素的影响，如温度、抗原修复方法、抗体浓度、孵育时间及显色时间等多种因素[2-4]。本研究中牙-牙周组织兼具软硬两种组织，切片制作难度较大，在抗原修复中保持切片完整较为复杂，研究使用3种方法分别为高压修复、酶修复、隔水热修复对组织切片进行染色以观察效果。

高压修复优点在于染色效果好，运用高压锅进行封闭的加热处理，加热效能大而均匀，但是组织脱片率很高，更适合于牙龈乳头等牙周软组织的免疫组化染色；酶消化修复是通过消化作用破坏修复液固定产生的蛋白交联，使抗原位点暴露，其巨噬细胞染色效果一般，但是组织脱片率低，也能有效观察到研究组织；隔水热修复效果居于高压修复和酶消化修复之间，染色率较好，脱片率居中[5-6]。

本研究中由于牙-牙周组织的特殊性，具有软硬两种组织，脱片情况发生较多，综合考虑高压修复、酶消化修复和隔水热修复，对三种抗原修复方法的染色率和脱片率综合分析，认为隔水热抗原修复的综合效果最好，虽然染色效果较好，且需延长修复时间，但能有效观察到研究组织且脱片率较低。

综上所述，在对牙-牙周免疫组化染色中，使用隔水热修复的综合效果最好。