胚胎植入前遗传学非整倍体检测在高龄和复发性流产患者中的应用

孔娜娜，陈蕾，王伟周，李敏，闫玲，沈玉良，刘斌，左海洋

胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing, PGT)是指辅助生殖技术中对植入前的胚胎进行基因突变或染色体检测，选择正常的胚胎进行移植。非整倍体检测技术(preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)即可对具有染色体非整倍体性风险的胚胎进行染色体数目的检测，进而指导临床上选择整倍体胚胎进行移植。目前其适应症主要为：高龄、不明原因反复移植失败、夫妇双方核型正常但有多次流产史等患者。然而，其能否提高临床妊娠率一直饱受争议[1-3]。有研究表明高龄或复发性流产(recurrent pregnancy loss，RPL)患者可在PGT-A中获益，但仍缺乏足够的临床数据支持[4-5]。目前我国高龄不孕诊治指南中指出高龄女性优质胚胎数量少、治疗费用高、胚胎移植后不能确保妊娠等，因此对高龄患者有适应证者应酌情实施PGT-A[6-7]。复发性流产原因复杂，约50%与胚胎非整倍体相关。非整倍体可导致流产，并且与患者年龄正相关。年龄大于35岁的复发性流产患者，80%的妊娠12周内流产是由于胚胎非整倍体导致。PGT-A可筛选整倍体胚胎，但有随机对照实验研究认为PGT-A并不能提高RPL患者的持续妊娠率和降低流产率[5]。因此，PGT-A是否在高龄、复发性流产患者中改善其临床结局需要更多的临床数据来证实[8]。本研究回顾性分析2017年1月至2019年6月来解放军总医院第六医学中心妇产科辅助生殖中心行PGT-A的相关病例，进行分析总结，探究PGT-A在高龄和复发性流产患者中临床作用。

1 材料与方法

1.1 研究资料

本研究回顾性分析2017年1月至2019年6月于中国人民解放军总医第六医学中心妇产科辅助生殖中心行PGT-A的116例患者的132个单囊胚冻融移植周期病历资料，患者年龄(35.6±3.9)岁，范围27～44岁，以及2018年1月至2018年12月期间未行PGT-A的202例患者的216个单囊胚冻融周期病资料，患者年龄(35.5±4.7)岁，范围27～46岁。将行PGT-A和未行PGT-A的患者按不同年龄段分为3组：年龄≥38岁，年龄35～37岁，年龄<35岁。将行PGT-A和未行PGT-A的患者按是否为RPL，分为RPL-PGT-A组和RPL-非PGT-A组。RPL患者的流产次数 ≥ 3，且妊娠时间小于28周，夫妻双方染色体核型正常。患者和家属同意参与研究，并签署知情同意书。此次研究经医院伦理委员会批准，批准号为HZKY-10J-2021-24。

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚期活检 选取D5或D6囊胚进行滋养外胚层活检，在内细胞团对侧用激光破膜系统在透明带上打孔，继续将囊胚培养4～6 h，使部分滋养层形成疝。活检时，使内细胞团位于固定针一侧，活检针靠近形成疝的外滋养层细胞缓慢回吸，并利用激光打孔，直至活检的外滋养层细胞全部脱离囊胚。活检组织在配子缓冲液中清洗后装入含有2 μl单细胞裂解液的PCR管中，-20 ℃冷冻保存待用。

1.2.2 胚胎移植 移植胚胎数目严格按照卫生部规定进行，未行PGT-A的优先选择形态学发育等级高的1枚囊胚进行移植，行PGT-A的则结合染色体检测结果，选择形态学好且染色体核型正常的1枚囊胚进行移植。移植术后采用改进的护理措施，以提高患者的医疗综合满意度[9]。

1.2.3 妊娠确定和各指标比率的计算方法 HCG阳性为囊胚移植后12 d血HCG>30 IU/ml。临床妊娠数为囊胚移植后28 d左右，B超下可见孕囊或胎心的数量。HCG阳性率=HCG阳性数/FET周期数×100%；生化妊娠损失率=仅生化妊娠数/HCG阳性数×100%；临床妊娠率=临床妊娠数/FET周期数×100%；活产率=活产婴儿数/FET周期数×100%；早期流产率=妊娠12周前的自然流产数/临床妊娠数×100%；流产率=流产数/临床妊娠数×100%；整倍体囊胚率=整倍体囊胚数/活检囊胚数×100%。

1.2.4 全基因组扩增、测序和数据分析 根据亿康公司的全基因组扩增试剂盒说明书，采用多次退火环状循环扩增的二代测序技术对活检的细胞进行全基因组扩增、建库，使用Illumina HiSeq 2500平台测序及数据分析[10]。

1.2.5 116对行PGT-A夫妇不孕指征情况 本研究纳入116对行PGT-A的夫妇，并对PGT-A各主要指征的人数进行统计，结果显示高龄或RPL患者占PGT-A总人数的比例远远高于体外受精(in vitro fertilization, IVF)失败史或男方因素不孕不育的患者比例。见表1。因此，该研究将对高龄或RPL患者行PGT-A的临床结局进行归纳和分析。

表1 统计116对行PGT-A夫妇不孕指征所占比率

1.3 统计学处理

选择SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同年龄组行PGT-A和未行PGT-A患者的基本信息

通过对不同年龄组患者的个人资料进行统计和分析，结果表明在各年龄组中，行和未行PGT-A的患者在年龄、体质量指数(body mass indes, BMI)、流产次数上差异无统计学意义(P>0.05)。另外，未行PGT-A的患者不进行活检操作，无法检测囊胚整倍体性，故只统计行PGT-A患者的整倍体囊胚率。结果表明，整倍体囊胚率在行PGT-A的年龄≥38岁，年龄35～37岁，年龄<35岁患者中逐渐升高。进一步比较行PGT-A的患者，结果表明， 年龄35～37岁组的整倍体囊胚率高于年龄≥38岁组，差异有统计学意义(P<0.05)；年龄<35岁组的整倍体囊胚率高于年龄35～37岁组，差异无统计学差异(P>0.05)；年龄<35岁组的整倍体囊胚率高于年龄≥38岁组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同年龄段患者行PGT-A和未行PGT-A的临床结局比较

2.2 比较不同年龄组患者行PGT-A与未行PGT-A的临床妊娠结局

在年龄≥38岁中，行PGT-A可有效提高患者的HCG阳性率、临床妊娠率和活产率，差异有统计学意义(P<0.05)。在年龄35～37岁和年龄<35岁中，行PGT-A在HCG阳性率、临床妊娠率和活产率上和未行PGT-A比较差异无统计学意义。另外，行PGT-A患者的生化妊娠损失率和流产率在各组中有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同年龄段患者行PGT-A和未行PGT-A的临床结局比较

2.3 89位RPL患者的基本资料 为了进一步探究PGT-A能否改善RPL患者的临床结局，本研究纳入89位RPL患者，其中行PGT-A的患者66位，未行PGT-A的患者23位。2组均为单囊胚冷冻解冻后进行移植。通过对RPL患者的基本资料进行分析，结果表明2组在年龄、BMI、流产次数、吸烟者和抗磷脂综合征所占比率上比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 统计89位RPL患者的基本资料

2.4 PGT-A在89位RPL患者临床结局中的作用 对行PGT-A和未行PGT-A的RPL患者的临床结局进行分析，结果表明，PGT-A可显著降低RPL患者的生化妊娠损失率和早期流产率，差异有统计学意义(P<0.05)，临床妊娠率和活产率有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 89位RPL患者行PGT-A与未行PGT-A的临床结局的比较

3 讨论

目前对囊胚滋养外胚层细胞进行活检，然后对胚胎进行玻璃化冷冻，再采用高通量测序技术对样品进行分析，已成为PGT-A的金标准方法。2017年世界范围内的网上调查[11]显示约占77%的386个生殖中心仍然采用PGT-A筛选胚胎进行移植。尽管近年来PGT-A的应用迅猛发展，其临床作用仍然饱受争议[2]。由于活检操作具有侵入性，因此需要更多的研究证实哪些适应症人群更能从PGT-A中获益。本生殖中心就诊的PGT-A患者主要为高龄和RPL人群，样本相对其他适应症较多，因此本研究通过回顾性分析若干移植周期病历，探究PGT-A是否可以改善高龄和RPL患者的妊娠结局。

为了研究女性年龄对胚胎整倍性及妊娠结局的影响，将女性年龄分为3组，结果表明年龄≥38岁，年龄35～37岁，年龄<35岁组患者的囊胚整倍体率随女性年龄的下降逐渐增高，证实了整倍体率的变化跟女性的年龄密切相关[12]，其中年龄大于38岁的女性整倍体囊胚率仅为34.5%。在年龄≥38岁中，行与未行PGT-A相比，前者可有效地提高患者的HCG阳性率、临床妊娠率和活产率。每移植周期的活产率几乎提高2倍，与近年来的研究结果相似[13]。在年龄≥38岁组中行与未行PGT-A的临床妊娠率相差较大(P<0.05)，未行PGT-A患者的临床妊娠率略低，可能与生化妊娠损失率偏高及年龄≥38岁患者整倍体囊胚率偏低相关。而在年龄35～37岁和年龄<35岁中，行PGT-A似乎没有改善患者的临床结局，提示了在年龄<38岁的患者中，选择形态学较好的囊胚移植或许就能获得较好的临床妊娠率和活产率。Murphy等人的研究认为在年龄<38岁患者中，与未行PGT-A组相比，PGT-A组每移植周期的活产率没有差异，而对年龄>38岁患者，采用PGT-A对第1次移植周期的患者最为有利[13]。Kang等人回顾性地比较了同一时期移植整倍体胚胎和新鲜囊胚的患者，发现年龄小于37岁患者的临床妊娠率、活产率、生化妊娠或流产率没有差异。而对年龄>37岁的患者，移植整倍体胚胎提高了临床妊娠率和活产率，但生化妊娠和流产率没有变化[14]。在本研究中行PGT-A的流产率与未行PGA-A的流产率相比较在3个年龄组中均有所下降，但无显著性差异。另大规模的随机地照实验实验结果表明PGT-A组与对照组的临床结局没有统计学上的显著差异，而年龄大于38岁的患者中临床结局仅略有改善[15]。本研究结果证实年龄大于38岁的高龄患者采用PGT-A筛选整倍体囊胚可能会提高临床妊娠率和活产率，有助于改善妊娠结局。

RPL的病因复杂，一般认为多由胚胎非整倍体导致，早期流产组织染色体检测显示约50%～60%胚胎存在染色体异常。另外子宫腔内膜情况、双方的核型和抗磷脂抗体也是导致RPL的因素。本研究纳入统计的患者夫妻双方核型正常，母方在流产次数、吸烟情况和抗磷脂综合征等基本资料上并无差异。RPL-非PGT-A患者的FET周期仅有32例，一方面是因为近年来多数RPL患者选择PGT-A治疗，另一方面，一部分未行PGT-A的高龄RPL患者会选择在卵裂期冷冻胚胎后移植。通过比较行与未行PGT-A的2组RPL患者的妊娠情况，结果表明前者显著降低了生化妊娠损失率(P<0.05)，Sato等的研究结果也证明了PGT-A可显著降低RPL患者的生化妊娠损失[16]，提示生化妊娠丢失的原因可能是胚胎染色体异常。早期流产率也显著下降(P<0.05)，提示行PGT-A可进一步的筛选整倍体胚胎，并有效的降低妊娠损失。另有小样本的数据也证明PGT-A可显著降低RPL的早期流产率[17]。

另外，虽然PGT-A在世界范围内用于RPL患者筛选胚胎移植，但能提高活产率和防止流产的证据很少[18]。本研究结果表明PGT-A能提高RPL患者每移植周期的临床妊娠率和活产率，但无统计学差异。有研究认为PGT-A并不能提高每位病人的活产率：一项研究发现，使用PGT-A和期待治疗分别治疗不明原因的RPL患者(人数分别为232例和302例)，虽然PGT-A降低了流产率，但活产率并没有提高[19]。Sato等的研究表明PGT-A改善了RPL组每移植周期的活产率，但并没有提高患者的活产率，然而与未行PGT-A的病人相比，PGT-A确实在减少达到相同活产数所需的胚胎移植数量方面具有优势[16]。本研究的不足之处为入组的例数有限，故仍需更多的样本进行分析和总结。另PGT-A的花费和怀孕需要的时间等是否利于患者治疗也需要更多大规模的随机对照实验研究证明。

综上，本研究的结果表明辅助生殖技术中，PGT-A可显著改善年龄≥38岁的高龄女性的妊娠结局，同时能够降低RPL患者的早期流产率，减少妊娠损失。