CMTM6基因作为免疫浸润相关的泛癌预后生物标志物

陈 熹，宋红权，焦晓辉

1.哈尔滨医科大学口腔医学院，黑龙江 哈尔滨 150001；

2.哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150001

CMTM是人类趋化因子样基因超家族的新成员，该家族还包括CMTM 1-8［1］。CMTM6是一种广泛表达的蛋白，以簇状形式存在于人类染色体3p23上。它与其他家族成员的蛋白产物具有序列同源性，并具有潜在的四次膜穿透结构。近年来，CMTM6与肿瘤发生的关系受到了越来越多的关注。CMTM6在胶质瘤中的表达与不良预后相关，其表达与抑制性T细胞表达呈正相关［2］。相关报告中表示CMTM6在非小细胞肺癌中与更长的总生存期显著相关［3］。之前的研究表明CMTM6在不同的肿瘤中发挥不同的作用。肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。在肺鳞癌中，CMTM6表达与CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞浸润呈正相关，与CD4+T细胞浸润呈负相关［4］。因此，充分了解CMTM6与免疫微环境之间的关系对于免疫微环境的研究，对于患者进一步治疗具有重要意义。在这项研究中，使用包括PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter等在内的数据库，将CMTM6在泛癌症中的预后景观可视化。然后，利用TIMER数据库探讨了CMTM6表达与免疫浸润水平之间的潜在关系。这项研究的结果表明，CMTM6可能是通过它与浸润性免疫细胞之间的相互作用，影响癌症患者的预后。

1 资料与方法

1.1 TIMER中计算CMTM6基因表达量

TIMER（http://cistrome.org/TIMER/）是一款肿瘤浸润免疫细胞组分分析网站，既可以比较肿瘤样本和正常组织中基因表达量的差异，同时输入肿瘤样本的基因表达谱数据，也可以预测每个肿瘤样本中浸润的免疫细胞组成。

1.2 PrognoScan和Kaplan-Meier Plotter中的生存分析

PrognoScan、Kaplan-Meier Plotter中分析了CMTM6的表达与泛癌中的生存的相关性［5］。具体而言，在PrognoScan的所有可用微阵列数据集中搜索CMTM6的表达水平，以确定其与包括总体生存期（OS）和无疾病生存期（DFS）在内的预后的关系。阈值设置为Cox P＜0.05。我们探讨了CMTM6表达在每种可获得的癌症类型中对OS和DFS的影响。Kaplan-Meier Plotter是一个强大的线上工具，可以用来评估21种癌症类型中54 000个基因对生存的影响。研究者分析了CMTM6在肾透明细胞癌（KIRC）、肝细胞癌（LIHC）、胰腺导管腺癌（PDAC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、膀胱癌（BLCA）乳腺癌（BRCA）、胸腺瘤（THYM）、甲状腺腺瘤（THCA）中的表达与总生存期（OS）、无复发生存期（RFS）的关系，计算了log-rank P值和95%置信区间（CI）的风险比率（HRs）。

1.3 TIMER中CMTM6表达与免疫细胞的相关性

用TIMER测定CMTM6表达与免疫浸润的关系［6］。TIMER是系统分析多种癌症类型免疫浸润的理想资源。TIMER应用先前发表的统计反褶积方法，从基因表达谱中推断肿瘤浸润免疫细胞的丰度［7］。TIMER数据库包含来自TCGA的多种癌症类型的10 897个样本，以评估免疫浸润的丰度。分析CMTM6的表达与总共6种免疫浸润细胞的丰度之间的关系，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。ESTIMATE（使用表达数据估计恶性肿瘤组织中的基质细胞和免疫细胞）是一种预测肿瘤纯度以及使用基因表达数据预测肿瘤组织中浸润的基质/免疫细胞的工具。利用ESTIMATE算法来推断每个样品的免疫评分。

1.4 统计学方法

采用Kaplan-Meier法评估生存曲线。为了比较生存曲线，采用时序检验来计算Kaplan-Meier Plotter中的HR值和logrank P值。采用单变量Cox回归模型在PrognoScan中计算HR和Cox P值。用斯皮尔曼相关系数评价基因表达的相关性，差异有统计学意义P＜0.05。

2 结果

2.1 泛癌中CMTM6的mRNA表达水平

为了明确在泛癌中的CMTM6表达，用TIMER检测了TCGA中的RNA测序数据。肿瘤和邻近正常组织中差异的CMTM6表达模式如图1所示。肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）中CMTM6的表达低于正常组织。在皮肤黑色素瘤（SKCM）中，CMTM6在原发部位的表达要低于转移部位。同时，CMTM6的表达在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、结肠腺癌（COAD）、食道癌（ESCA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、胃癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）中明显高于正常组织。在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）中，HPV阳性的CMTM6表达稍高于HPV阴性。

图1 CMTM6在TCGA的不同种癌症中的表达水平（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.2 CMTM6在癌症中的预后价值

在不同数据库中研究了CMTM6对泛癌的预后价值。在PrognoScan中，探讨了每个癌症中CMTM6表达与预后的关系。结果总结在图2中。值得注意的是，CMTM6的表达与总共9种癌症类型显著相关，包括星形细胞瘤（Astrocytoma）、神经胶质瘤（Glioma）、乳腺癌（BRCA）、滤泡性淋巴瘤（FL）、结直肠癌（COREAD）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）、卵巢癌（OV）、肺腺癌（LUAD）（图2）。其中，CMTM6在3种癌症类型中发挥了不利作用，包括星形细胞瘤（Astrocytoma）［OS：总数=77，HR=2.83，Cox P=0.004 306］，神经胶质瘤（Glioma）［OS：总数=74，HR=2.49，Cox P=0.021 147］，结直肠癌（COREAD）［DFS（无病生存期）：总数=145，HR=2.40，Cox P=0.019 720］。同时，CMTM6在其他6种癌症类型中起保护作用，包括乳腺癌（BRCA）［RFS（无复发生存期）：总数=77，HR=0.14，Cox P=0.036 128］，滤泡性淋巴 瘤（FL）［OS：总数=180，HR=0.45，Cox P=0.001 493］，皮肤黑色素瘤（SKCM）［OS：总数=38，HR=0.21，Cox P=0.014 290］，葡萄膜黑色素瘤（UVM）［DMFS（无远处转移生存期）：总数=63，HR=0.69，Cox P=0.039 375］，卵巢癌（OV）［OS：总数=185，HR=0.72，Cox P=0.000 359］，肺腺癌（LUAD）［RFS：总数=204，HR=0.46，Cox P=0.000 03］。

图2 CMTM6在PrognoScan的不同种癌症中高低表达的Kaplan-Meier生存曲线的比较（a-i）

使用来自TCGA的主要基于Affymetrix微阵列信息的Kaplan-Meier Plotter，研究者进一步评估了CMTM6相关总生存期（OS）（图3）。CMTM6在4种癌症中预后较差，肾透明细胞癌（KICH）［HR=1.43（1.05～1.93），logrank P=0.022］，肝细胞癌（LIHC）［HR=1.46（1.03～2.06），logrank P=0.033］，胰 腺 导 管 腺 癌（PDAC）［HR=1.94（1.28～2.95），logrank P=0.001 5］，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）［HR=4.93（0.89～27.18），logrank P=0.043］。在另外5种癌症中，CMTM6则起到了预后较好的作用：膀胱癌（BLCA）［HR=0.59（0.43～0.81），logrank P=0.001］，乳 腺 癌（BRCA）［HR=0.67（0.48～0.95），logrank P=0.025］，胸腺瘤（THYM）［HR=0.25（0.07～0.99），logrank P=0.034］，甲状腺腺瘤（THCA）［HR=0.33（0.1～1.01），logrank P=0.041］，子宫体子宫内膜癌（UCEC）［HR=0.62（0.4～0.96），logrank P=0.03］。

图3 CMTM6在Kaplan-MeierPlotter的不同种癌症中高低表达的Kaplan-Meier生存曲线的比较（a-i）

2.3 CMTM6表达与免疫浸润的相关性

肿瘤微环境中的免疫细胞可以影响患者生存率，上述发现支持CMTM6在泛癌中的预后作用。因此，探索免疫浸润与CMTM6表达之间的关系是有意义的。

研究列举了与免疫浸润相关性最强的三种癌症。在肾透明细胞癌（KIRC）中，CMTM6的表达水平与B细胞（R=0.38，P=1.02E-19），CD4+T细胞（R=0.37，P=1.03E-18），CD8+T细胞（R=0.392，P=5.65E-21），巨噬细胞（R=0.619，P=1.93E-57），中 性 粒 细 胞（R=0.573，P=1.07E-47）和树突状细胞（R=0.585，P=3.63E-50）的浸润水平呈显著正相关。在头颈鳞状细胞癌（HNSC）中，CMTM6的表达水平与B细胞（R=0.154，P=0.000 599），CD4+T细胞（R=0.387，P=3.52E-19），CD8+T细胞（R=0.192，P=1.7E-05），巨 噬 细 胞（R=0.302，P=6.54E-12），中性粒细胞（R=0.347，P=1.88E-15）和树突状细胞（R=0.396，P＜0.000 1）的浸润水平呈显著正相关。这些发现强烈提示CMTM6通过与结肠腺癌（COAD）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）等癌症的免疫浸润相互作用而影响患者的生存期。对于结肠腺癌（COAD）来说，CMTM6表达水平与B细胞（R=0.303，P=3.54E-11），CD8+T细胞（R=0.519，P=6.04E-33），CD4+T细胞（R=0.18，P=0.000 11），巨噬细胞（R=0.362，P=1.22E-15），中 性 粒 细 胞（R=0.374，P=1.1E-16）和树突状细胞（R=0.397，P=9.84E-19）的浸润水平呈显著正相关。

为了探讨CMTM6表达与免疫评分之间的潜在相关性，我们应用了ESTIMATE算法来计算TCGA队列中每个样品的免疫评分（图4）。CMTM6表达与乳腺癌（BRCA）、宫颈癌（CESC）、结肠腺癌（COAD）、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBC）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）、急性髓性白血病（LAML）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、肉瘤（SARC）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、胸腺癌（THYM）的免疫浸润相关。结果表明，在某些癌症类型中，CMTM6表达与高免疫浸润有关。

图4 CMTM6表达和免疫评分的关系

3 讨论

肿瘤微环境（TME）含有多种细胞。其中，浸润性免疫细胞占很大比例。一方面，与传统观念将免疫细胞作为抗肿瘤策略的组成部分不同，TME中的免疫浸润反映了肿瘤细胞避免被杀死的策略。此外，除了巨噬细胞，几乎所有类型的免疫细胞，包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞和树突状细胞（DC），都存在于TME中，有些参与了癌症的发展。相反作为经典抗癌治疗的替代疗法，针对免疫细胞和肿瘤细胞之间相互作用的免疫治疗，近年来已经被开发出来，用以重新激活适应性免疫系统和固有免疫系统，并创造一个强大的抗肿瘤免疫反应。然而，只有在某些特定癌症类型中，有限比例的患者对现有的免疫治疗反应良好。因此，有必要探索其他潜在靶向。

本研究探讨了CMTM6的表达水平，在TIMER数据库中，发现与正常组织中的表达水平相比，CMTM6在皮肤黑色素瘤（SKCM）中，CMTM6在原发部位的表达要低于转移部位。同时，CMTM6的表达在膀胱癌（BLCA）、COAD结肠腺癌（COAD）、食道癌（ESCA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、胃癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）中高表达，而在肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）中的表达水平较低。在多种数据库中确定了在CMTM6表达的预后价值。对于患者的预后来说，在Prognoscan数据库中，CMTM6在三种癌症类型中发挥了不利作用，包括星形细胞瘤，神经胶质瘤，结直肠癌（COREAD）。同时，CMTM6在其他六种癌症类型中起保护作用，包括乳腺癌，滤泡性淋巴瘤，皮肤黑色素瘤（SKCM），葡萄膜黑色素瘤（UVM），卵巢癌（OV），肺腺癌（LUAD）。在Kaplan-Meier Plotter对CMTM6的分析表明，CMTM6在四种癌症中有害，包括肾透明细胞癌（KIRC），肝细胞癌（LIHC），胰腺导管腺癌（PDAC），嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）。在另外五种癌症中，CMTM6则起到了保护作用，包括膀胱癌（BLCA），乳腺癌（BRCA），胸腺瘤（THYM），甲状腺腺瘤（THCA），子宫体子宫内膜癌（UCEC）。综上所述，这些发现有力地表明CMTM6可以作为泛癌预后的生物标志物。

肿瘤免疫浸润细胞从血液迁移到肿瘤组织，并在免疫调节中起重要作用。越来越多的研究表明，肿瘤免疫浸润细胞与免疫检查点抑制和预后的功效密切相关。为了阐明CMTM6表达与各种免疫细胞之间的关系，使用TIMER检查了癌症类型中浸润免疫细胞类型的相对分数，确定CMTM6表达是否与不同癌症的免疫浸润水平相关。与CD8+T细胞有关的癌症有肾上腺皮质癌（ACC）、膀胱癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、结肠腺癌（COAD）、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBC）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、间皮瘤（MESO）、胰腺癌（PAAD）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、前列腺瘤（PRAD）、直肠癌（READ）、肉瘤（SARC）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、胃癌（STAD）、甲状腺癌（THCA），与CD4+T细胞有关的癌症有头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、胸腺癌（THYM），与中性粒细胞有关的癌症为肾上腺皮质癌（ACC）、乳腺癌（BRCA）、宫颈癌（CESC）。

然而，尽管在多个数据库中整合了信息，但这项研究仍然有局限性。首先，通过分析肿瘤组织信息，收集了大量的微阵列和测序数据。因此，免疫细胞标记物的细胞水平分析可能引入了系统误差。为了克服这一问题，日后应进行更高分辨率的研究，如使用单细胞测序。其次，这些数据库中没有反映CMTM6的分子功能。最后，本研究仅对CMTM6在不同数据库中的表达和患者生存期进行了生物信息学分析，未进行体内或体外实验。未来在细胞和分子水平上对CMTM6的机制研究可以帮助阐明CMTM6的作用，可以帮助提供一个明确的答案。

总之，CMTM6可影响泛癌预后，并与免疫浸润有关，CMTM6与TME中有关。CMTM6可作为泛癌预后的生物标志物。这些发现可能提供了一种基于免疫的抗肿瘤策略，包括控制肿瘤细胞或肿瘤微环境浸润的能量系统。