绵羊肺炎支原体贵州株 P30 基因的遗传进化分析

万孝雪， 吴 燕， 杨 鹏， 郭小江， 肖 丽， 吴斌凤， 罗小芬， 程振涛，2*， 李凤龙

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025； 3. 贵州省草地技术试验推广站，贵州 贵阳 550025； 4.遵义市红花岗区海龙镇农业服务中心，贵州 遵义 563000)

绵羊肺炎支原体(Mycopiasmaovipneumoniae，Mo)是引起绵羊和山羊慢性呼吸道疾病的主要病原之一，发病症状及病理变化以喘气、咳嗽、渐进性消瘦、慢性增生性间质性肺炎为主[1]。1963年，Mackey J M K等[2]首次于绵羊胸膜肺炎病例中分离出Mo。后来经过Carmicheal L E等[3]证明了Mo的致病性，并引起世界各国的广泛关注。现已证实绵羊支原体肺炎呈全球性分布[4]。由于感染Mo后康复的绵羊和山羊也会长期携带此致病原，因此彻底控制和消灭此病较难，给养羊业造成严重的经济损失[5]。目前药物治疗绵羊支原体肺炎效果不佳，而绵羊肺炎支原体培养非常困难，产量低，疫苗制作成本高，疫苗实际预防效果也不理想，还没有可广泛应用的Mo疫苗。至今Mo疫苗在靶标基因的选择上仍存在很多困难，已公布完成全基因组测序的近缘物种仅有绵羊肺炎支原体四川分离株(Mo SC01)，而研究Mo免疫原蛋白及抗原组分的报道也较少。绵羊肺炎支原体Y98标准株(Mo Y98)存在4种主要蛋白抗原，相关研究显示Mo与猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)的70、50、40、25 ku蛋白存在共同抗原[6]。此外相关研究表明，Mo的 30 ku 蛋白P30具有良好的免疫原性[7]。本文通过MoP30基因扩增、克隆测序和序列分析，了解4株Mo贵州分离株P30基因的进化情况，为核酸疫苗靶标基因的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株Mo Y98(CVCC 384)标准株，由贵州大学预防兽医实验室保存；Mo贵州分离株(GZQX、GZXS、GZHZ、GZKY)，由贵州大学预防兽医实验室分离并保存。

1.2 主要试剂细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 bp DNA Marker、pMD19-T载体、限制性内切酶(BamH Ⅰ、HindⅢ)，购自TaKaRa公司；E.Z.N.ATMGel Extraction Kit胶回收试剂盒、E.Z.N.ATMPlasMid Kit质粒提取试剂盒，购自Omega公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器T20型双槽梯度PCR仪，购自杭州朗基科学仪器有限公司；Tanon 1600全自动数码凝胶成像系统，购自上海天能公司；HH-2数显恒温水浴锅，购自常州金坛良友仪器有限公司。

1.4P30基因的扩增

1.4.1 引物设计与合成参照GenBank的Mycoplasmahyopneumoniae7422外膜蛋白P30基因序列信息，设计合成引物MoP30基因特异性引物Mo-F/R(见表1)，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.4.2 Mo基因组DNA的提取对Mo Y98标准株和Mo贵州分离株(GZQX、GZXS、GZHZ、GZKY)进行培养，参照DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，提取物于-20 ℃保存备用。

1.4.3 MoP30基因PCR扩增采用PCR技术，分别以4株Mo贵州株和Mo Y98标准株DNA为模板，扩增MoP30基因。建立反应体系25 μL：引物Mo-F/R (10 μmol/L)各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。充分混匀，按下列反应程序进行目的基因PCR扩增：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取 PCR产物8 μL于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统观察目的基因扩增情况(预扩增片段884 bp)。

1.5 MoP30基因克隆与测序参照E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 胶回收试剂盒说明书进行目的基因胶回收纯化。向PCR管中加入已纯化的PCR产物4.0 μL、pMD-19T载体1.0 μL、Solution连接酶5.0 μL，构建连接体系10 μL，16 ℃连接过夜；将连接产物10 μL加入大肠杆菌感受态细胞(DH5α)50 μL，混匀后依次冰浴30 min，42 ℃热冲击90 s，冰浴3 min，最后加入经37 ℃预热的LB液体培养基至总体积1 mL混匀，37 ℃震荡培养1 h后涂布于含氨苄青霉素钠(Amp)的LB培养基，培养16 h后挑选单个菌落进行培养。取培养菌液提取质粒DNA，以质粒DNA为模板按1.4.3方法进行重组质粒PCR鉴定，构建双酶切体系30 μL：重组质粒17.0 μL、限制性内切酶BamH Ⅰ 1.0 μL和HindⅢ2.0 μL、10×Buffer R 2.0 μL、ddH2O 8.0 μL，进行重组质粒双酶切鉴定。将PCR鉴定及双酶切鉴定结果均为阳性的质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

1.6P30基因序列测定与分析利用primer 5.0软件将4株Mo贵州株P30基因序列与Mo Y98标准株、GenBank中12株其他支原体的P30基因进行核苷酸序列多重对比；构建系统进化树，利用MEGA 5.0 软件分析基因同源性及系统进化关系。参考菌株信息(见表2)。

表2 参考菌株序列

2 结果

2.1 MoP30基因扩增结果由图1可见：PCR扩增出长度约884 bp的清晰条带，与预期扩增片段相符。

M：DNA标准分子质量； 1、2：Mo Y98 株； 3：GZQX株；4：GZXS株； 5：GZHZ株； 6：GZKY株； 7：阴性对照图1 P30基因PCR扩增结果

2.2 目的基因克隆结果由图2可见：重组质粒pMD19T-P30PCR扩增产物含884 bp的特异性条带，双酶切产物为载体条带(2 692 bp)和目的条带(884 bp)，说明P30基因已插入pMD19-T载体。

2.3 MoP30基因变异性分析结果由图3可见：4株 Mo贵州株与Mo Y98标准株序列比对，GZXS株在第58位、59位出现缺失，第758位碱基出现突变；GZHZ株在第63位出现缺失，第684位、825位出现碱基突变；GZKY株在第63位、763位、781位、803位、818位、819位、836位、848位、879位共9处位置出现缺失，在第691位、814位、815位、817位处出现碱基突变；GZQX株仅在第63位处发生1个基因缺失。结果提示Mo贵州株存在部分基因缺失或突变，但数量较少。

图3 P30基因序列比对结果

2.4 MoP30基因同源性分析结果由图4 可见：4株Mo贵州株与Mo Y98标准株的P30基因序列相似性达94.9%以上。其中GZQX株与Mo Y98标准株同源性最高，达到99.4%；GZKY株与Mo Y98标准株同源性最低，为94.9%。Mo贵州株与Mo SC01同源性在72.2%～76.3%之间；与猪肺炎支原体(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)P30基因同源性在72.9%～78.0%之间；与絮状支原体(Mf ATCC)P30基因同源性在73.5%～79.8%之间；与其他种支原体同源性均在30.0%以下。结果提示MoP30基因具有良好的种属特异性。

图4 Mo贵州株与参考菌株基因序列同源性注：左下角数据为遗传距离，右上角数据为同源性

2.5 MoP30基因进化树分析由图5可见：4株Mo贵州株与Mo Y98标准株处于同一进化分支，亲缘关系最近；与牛支原体(Mbov)、鸡毒支原体(Mgalli 8750)亲缘关系次之；与Mo SC01、絮状支原体(Mf ATCC)、猪肺炎支原体(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)、肺炎支原体(Mp 309)亲缘关系较远。Mo SC01与猪肺炎支原体(Mhp 168-L、Mhp 168、Mhp 7448、Mhp 232、Mhp 7422)处于同一进化分支，亲缘关系最近。

图5 Mo贵州株与参考菌株核酸序列系统进化树

3 结论

本试验运用前期分离出的Mo贵州株(GZHZ、GZKY、GZQX、GZXS)通过PCR技术扩增Mo贵州株膜蛋白P30基因，将扩增序列与标准菌株Mo Y98P30基因序列进行比对，通过同源性分析发现Mo贵州株与Mo Y98标准株同源性较高，在94%以上；遗传进化分析发现Mo贵州株与Mo Y98标准株处于同一遗传进化分支；基因变异性分析发现Mo贵州株与Mo Y98标准株相比发生部分碱基的缺失和(或)突变，但总体非常保守。相关研究表明，Mo Y98标准株P30蛋白具有很好的免疫原性[7]，猪肺炎支原体P30蛋白也具有很好的抗原性[8]。本研究通过分析发现Mo贵州株P30基因与Mo Y98标准株P30基因、猪肺炎支原体P30基因同源性高，遗传进化关系近。综合上述分析认为，Mo贵州株P30基因可作为基因工程疫苗的候选靶标基因。