猪细小病毒病灭活疫苗佐剂筛选及配苗乳化工艺研究

李应鹤，初晓红，宋扬，徐刚，李贽，于镭

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）

猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）引起的一种猪繁殖障碍病，主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪产死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状[1]。猪细小病毒病目前尚无有效治疗方法，主要采取预防措施，因此猪细小病毒病疫苗的生产工艺研究尤为重要[2]。本研究分别使用MontanideTMISA 206 VG佐剂（简称206佐剂）和白油佐剂进行猪细小病毒病灭活疫苗的配制，首先比较白油佐剂和206佐剂之间乳化工艺差异，再通过疫苗的物理性状检测、安全性检验和效力检验，分析两种佐剂对疫苗免疫效果的影响[3]。

1 材料

1.1 制苗用病毒液

浓缩后的猪细小病毒L株灭活病毒液（浓缩前病毒液红细胞凝集价为1∶512），由哈药集团生物疫苗有限公司制备和提供。

1.2 主要试剂

MontanideTMISA 206 VG佐剂（206佐剂），购自法国赛比克公司；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA），购自Sigma公司；Span-80和Tween-80，购自广州西陇化工有限公司；硬脂酸铝，购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.3 红细胞凝集抑制抗原

猪细小病毒L株，批号为PPV-HI Ag-201401，红细胞凝集价为1∶512，规格为1.0 mL·瓶-1，均由哈药集团生物疫苗有限公司制备或提供。

1.4 血清

猪细小病毒阳性血清，批号为PPV-Pos-Serum-201401，HI效价为1∶512，规格为1.0 mL·支-1；猪细小病毒阴性血清，批号为PPV-Neg-Serum-201401，规格为1.0 mL·支-1，均由哈药集团生物疫苗有限公司制备或保存。

1.5 红细胞悬液

0.5%豚鼠红细胞悬液按现行《中国兽药典》进行制备。

1.6 试验动物

2～4日龄乳鼠，由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供；1.5～2月龄的仔猪和5～6月龄的初产母猪（猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI抗体效价不超过1∶8），购自黑龙江省哈尔滨市郊某猪场，品种为长白。

2 方法

2.1 MontanideTM ISA 206 VG佐剂疫苗配制

2.1.1 油相制备

将206佐剂置于油相制备罐中，加热至30℃，备用。

2.1.2 水相制备

使用检验合格的猪细小病毒灭活液作为水相，同时采用ST-S无血清培养液作为对照组水相。

2.1.3 乳化

将油相与水相按体积比为1∶1混合，真空或正压加料并循环搅拌至油相与水相充分混合，乳化成双相油乳剂。疫苗制备情况见表1。

表1 206佐剂1 000头份疫苗配制 mL

2.1.4 分装

无菌定量分装，加盖密封，粘贴标签，置2～8℃保存，备用。

2.2 白油佐剂疫苗的配制

2.2.1 油相制备

取注射用白油94份，加入硬脂酸铝1.5份，边加热边搅拌，直至完全透明，再加入4.5份Span-80，充分混匀，116℃高压灭菌30 min后备用。

2.2.2 水相制备

取检验合格的猪细小病毒灭活液，混合抗原96份，加入4份灭菌Tween-80，待Tween-80完全溶解，制备成白油佐剂疫苗所需的水相；取配制好的ST-S无血清培养液96份，加入4份灭菌Tween-80，待Tween-80完全溶解制备成对照组水相。

2.2.3 乳化

水相和油相按体积比1∶1.5混合，先将油相注入预混罐中，2 500 r·min-1搅拌，缓慢加入水相，再注入乳化罐，以10 000 r·min-1乳化5～8 min，使混合物充分乳化。疫苗制备情况见表2。

表2 白油佐剂1 000头份疫苗配制所需成分制备mL

2.2.4 分装

无菌定量分装，加盖密封，粘贴标签，置2～8℃保存，备用。

2.3 疫苗检验

2.3.1 性状检验

按《中国兽药典》附录对206佐剂疫苗和白油佐剂疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度进行检验。

2.3.2 无菌检验

按现行《中国兽药典》附录对206佐剂疫苗和白油佐剂疫苗进行无菌检验。

2.3.3 安全检验

用乳鼠检验：将2～4日龄乳鼠20只按表3随机分为4组，每组5只，每只皮下注射疫苗0.1 mL，观察7 d。

用猪检验：将断奶后1.5～2月龄猪8头按表3随机分为4组，每组2头，深部肌肉注射疫苗5 mL，观察21 d。

表3 不同佐剂疫苗与对照分组

2.3.4 效力检验及免疫期测定

将5～6月龄的初产母猪20头按表3分为4组，每组5头，第1组和第2组经颈部肌肉途径接种疫苗2.0 mL，第3组和第4组经颈部肌肉途径接种疫苗2.5 mL，另设对照猪5头，经颈部肌肉途径注射生理盐水2.0 mL。

各试验组初产母猪分别在免疫后第0、7、14、21、28、60、90、120、150、180、210天和240天对所有试验猪采血，分离血清，并测定猪细小病毒HI抗体效价。计算猪细小病毒HI抗体几何平均效价。

3 结果与分析

3.1 疫苗性状检验结果

对制备的4种疫苗进行性状比较，结果显示4种疫苗外观及稳定性一致，但采用206佐剂乳化工艺制备的疫苗与白油佐剂制备疫苗的黏度差异显著。结果见表4。

表4 疫苗性状检验结果

3.2 两种乳化工艺流程比较结果

206佐剂与白油佐剂两种乳化工艺流程比较，可以看出，猪细小病毒病灭活疫苗（L株，悬浮培养）在车间生产的情况下，配苗乳化采用206佐剂工艺相对简单。结果见表5。

表5 乳化工艺流程比较结果

3.3 无菌检验结果

经接种T.G、G.A和G.P培养基检验，4种疫苗均无细菌、霉菌污染。

3.4 安全性试验结果

3.4.1 乳鼠安全性检验结果

以实验室制备的这4种疫苗（见表3），分别按0.1 mL·只-1颈部皮下注射3日龄同窝乳鼠5只，观察7 d。结果显示，分别用4种疫苗接种乳鼠后，在观察期内接种乳鼠全部健活，且无局部和全身不良反应。

3.4.2 猪安全性检验结果

以实验室制备的这4种疫苗（见表3），分别经深部肌肉注射疫苗5 mL·头-1，接种1.5～2月龄的猪2头，观察21 d。结果显示实验室制备这4种疫苗注射猪后，在观察期内接种猪全部健活，且无局部和全身不良反应。

3.5 效力检验及疫苗免疫期测定结果

以实验室制备的这4种疫苗（见表3），各经颈部肌肉免疫5月龄的初产母猪，每组5头。免疫后第7天分别测定猪细小病毒HI抗体效价，计算免疫HI抗体几何平均效价，进行疫苗效力评估，并进行疫苗免疫期测定。

免疫后第7天，第1组（见表3）免疫猪产生HI抗体显著高于第3组；免疫后第60天，第1组免疫猪HI抗体达到峰值。第1组免疫6个月后的HI效价仍大于规程要求的1∶64，可以满足猪生长期免疫保护的需要。

4 结论

使用MontanideTMISA 206 VG佐剂制备疫苗，乳化工艺相对简单；制备疫苗剂型为水包油包水型，黏度低，易注射，吸收良好；局部和全身均无不良反应，安全性良好；免疫后第7天猪细小病毒206佐剂疫苗免疫猪产生HI抗体显著高于白油佐剂疫苗，抗体效价高；免疫期为6个月，可以满足免疫保护期要求，因此确定MontanideTMISA 206 VG佐剂作为猪细小病毒病灭活疫苗的佐剂。