气相色谱－串联质谱法测定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中N－亚硝基二甲胺和 N

气相色谱－串联质谱法测定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中N－亚硝基二甲胺和 N－亚硝基二乙胺含量

2021-08-16王璐，刘峰

中国药业 2021年15期

王璐，刘峰

（四川省药品检验研究院·四川省医疗器械检测中心·药物制剂体内外相关性技术研究重点实验室，四川成都 611731）

氯哌斯汀为中枢性镇咳药，通过抑制咳嗽中枢而产生镇咳作用，也有微弱的抗组胺作用，无成瘾性及耐受性，临床用于治疗呼吸道感染引起的咳嗽。芬地柞酸左旋氯哌斯汀为左旋氯哌斯汀与芬地柞酸所制成的盐，活性更高，疗效是外消旋氯哌斯汀的数倍，基本无副作用［1］，市场需求量较大。但其生产过程中可能产生或被污染亚硝胺类杂质 N－亚硝基二甲胺（NDMA）和 N－亚硝基二乙胺（NDEA）。2018 年7 月在缬沙坦原料药中检出了各类亚硝胺杂质，且在非沙坦类药物中检出了亚硝胺类杂质。亚硝胺类杂质属人用药品注册技术要求国际协调会议（ICH）M7（R1）《评估和控制药物中 DNA 反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》提及的“关注队列”物质［2］。根据世界卫生组织公布的致癌物清单［3］，NDMA和NDEA 属2A 类致癌物质，故有必要测定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中NDMA 和NDEA 的含量。目前，关于亚硝胺类杂质的检测方法多针对沙坦类或二甲双胍类药物［4－8］，本研究中建立了同时测定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中NDMA和NDEA 含量的气相色谱－串联质谱（GC－MS／MS）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

7890B ＋7000D 型气质联用色谱仪（美国安捷伦公司），配有7693 型自动液体进样器，电子轰击离子源（EI）及 MasshunterB.07.06 工作站；Sartorius CPA255D型准微量天平（德国赛多利斯公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

芬地柞酸左旋氯哌斯汀（四川摩尔生物制药有限公司，批号分别为 200501，200601，190801）；NDMA 对照品（东京化成工业株式会社，含量为99.0%，批号为TFRMG）；NDEA 对照品（美国 J＆ K 公司，含量为99.0%，批号为LKB0S44）；水为超纯水（德国赛多利斯公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国Fisher 公司）

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦DB－WAX 毛细管柱（30m×0.25mm，0.5μm，固定液为聚乙二醇）；程序升温：起始温度为40℃，维持 0.5 min，以 20 ℃ ／min 的速率升温至 180 ℃ ，再以50 ℃ ／min 的速率升温至 240 ℃，保持 8 min，恒流模式；流速：1.0 mL ／min；载气：氦气；进样口温度：250 ℃，脉冲不分流进样；进样压力：15 psi；持续时间：1.5 min；进样量：2 μL；采用安捷伦5190－2293 超惰性不分流衬管。

2.1.2 质谱条件

检测器：三重四极杆串联质谱检测器，电离源为EI，电离能量为70 eV，离子源温度为280 ℃，四极杆温度为150 ℃；质谱传输接口温度：250 ℃；增益因子：10；溶剂延迟时间：5.5 min，运行时间：7.5 min；采集模式：多反应监测模式（MRM）；NDMA 的扫描：开始时间为5.5 min，定量离子对质荷比为（m ／ z）74→44，碰撞能量为2 eV，定性离子对为74→42，碰撞能量为6 eV；NDEA的扫描：开始时间为 6.6 min，定量离子对 m ／ z 为102→85，碰撞能量为2 eV，定性离子对 m／ z 为102→56，碰撞能量为6 eV。

2.2 溶液配制

分别取NDMA 和NDEA 对照品100 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加二氯甲烷溶解，并稀释至刻度，摇匀，得 NDMA 和 NDEA 质量浓度均为 10 mg ／mL 的对照品贮备液；分别精密量取NDMA 和NDEA 对照品贮备液适量，加二氯甲烷逐级稀释，得NDMA 和NDEA 的质量浓度分别为900 ng／mL 和250 ng／mL 的混合对照品贮备液；精密量取混合对照品贮备液1 mL，置100 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得NDMA和 NDEA 的质量浓度分别为 9 ng ／mL 和 2.5 ng ／mL 的混合对照品溶液；取芬地柞酸左旋氯哌斯汀0.1 g，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加适量二氯甲烷超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性及系统适用性试验：精密量取空白溶剂（二氯甲烷）、混合对照品溶液、供试品溶液各2 μL，分别按2.1 项下条件进样测定6 次，并记录色谱图。结果空白溶剂不干扰测定，供试品溶液色谱中无其他杂质峰干扰。详见图1。

图1 气相色谱－串联质谱图1. NDMA 2. NDEAA. Blank solvent B.Test solution C.Mixed reference solutionFig.1 GC －MS ／MS spectrograms

线性关系考察：精密量取2.2 项下混合对照品贮备液 10，25，50，100，250，500 μL，分别置 10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为线性关系考察系列标准溶液，按2.1 项下条件测定，记录色谱图。分别以质量浓度（X，ng／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，线性方程分别为 YNDMA＝ 4 250.9XNDMA－3 749.8（r ＝ 0.998 3，n ＝ 6），YNDEA＝ 2 901.6 XNDEA－ 406.8（r ＝0.9998，n ＝6）。结果表明，NDMA 和 NDEA 质量浓度分别在 0.922 2 ～46.1093 ng／mL 和 0.235 6 ～11.781 0 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限（LOD）与定量限（LOQ）测定：取 2.2 项下NDMA 和NDEA 对照品贮备液逐级稀释，以信噪比（S／ N）为3 时的进样量折算后作为LOD；以 S／ N 为10 时的进样量折算后作为LOQ。结果见表1，表明方法灵敏度高，可满足检测需要。

表1 NDMA 和NDEA 的检测限与定量限测定结果Tab.1 LOD and LOQ of NDMA and NDEA

稳定性试验：因芬地柞酸左旋氯哌斯汀中均未检出NDMA 和NDEA，故取对照品溶液和加标供试品溶液分别于 0，3，6，9，13，15 h 时注入气质联用色谱仪，记录色谱图。结果对照品溶液中，NDMA 和NDEA 峰面积的RSD 分别为 5.09%和 6.98% （n ＝ 6），加标供试品溶液中 NDMA 和 NDEA 峰面积的 RSD 分别为 5.19% 和7.16%（n ＝ 6），表明供试品溶液在 15 h 内稳定。

精密度试验：取对照品溶液，注入气质联用色谱仪，按2.1 项下条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果NDMA 和 NDEA 峰面积的 RSD 分别为 1.42% 和1.02%（n ＝ 6）。取 LOQ 测定项下溶液，注入气质联用色谱仪，按2.1 项下条件连续进样测定6 次，记录色谱图。结果 NDMA 和NDEA 峰面积的 RSD 分别为 1.92%和7.79%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为 200501）0.1 g，共 6 份，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下条件测定。结果样品中均未检出NDMA 和NDEA，故考察加标重复性。取样品（批号为 200501）0.1 g，精密称定，共6 份，精密加入混合对照品贮备液0.1 mL，即得加标供试品溶液，依法进样测定。结果NDMA 和NDEA的平均含量分别为 0.95 μg ／g 和 0.22 μg ／g，RSD 分别为 1.92%和 4.81%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为200501）0.1 g，共9份，精密称定，置10 mL 容量瓶中，分别精密加入混合对照品贮备液 0.05，0.10，0.15 mL，各 3 份，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，同时配制对照品溶液，以重复性试验测定结果作为样品本底值，按2.1 项下条件进样测定，记录色谱图。按外标法计算NDMA 和NDEA 的含量和回收率，结果见表2。

表2 NDMA 和 NDEA 加样回收试验结果（n ＝ 9）Tab.2 Results of the recovery tests of NDMA and NDEA（n ＝9）

耐用性试验：取供试品溶液（批号为200501）、加标（100%浓度）供试品溶液及对照品溶液，分别按下列条件：耐用性1，调整进样口温度为230 ℃；耐用性2，调整进样口温度为 270 ℃；耐用性 3，调整流速为 1.1 mL ／min；耐用性4，调整升温程序起始温度为40 ℃，维持0.5 min，以 18 ℃ ／min 的速率升温至 180 ℃ ，再以 50 ℃ ／min 的速率升温至240 ℃，保持8 min；耐用性5，调整升温程序起始温度为 40 ℃，维持 0.5 min，以 22 ℃ ／min 的速率升温至 180 ℃，再以 50 ℃ ／min 的速率升温至 240 ℃，保持8 min，测定NDMA 和NDEA 的含量。结果供试品溶液中各条件下均未检出NDMA 和NDEA，加标供试品溶液各条件下 NDMA 和 NDEA 含量测定结果的 RSD 分别为3.07%和 6.46%（n ＝5），表明色谱条件在一定范围变化时，方法耐用性良好。

2.4 样品中NDMA 和NDEA 含量测定

取 3 批样品（批号分别为 200501，200601，190801），按 2.1 项下条件进样测定。结果 3 批样品中均未检出 NDMA 和 NDEA。

3 讨论

3.1 控制策略

照EMA／511347／2019 文件要求，需对所有化学合成药物中亚硝胺的潜在污染进行风险评估。而遗传毒性杂质的控制策略包括源头控制，如起始物料、反应试剂等的控制；过程控制，如生产环境的设备运行条件控制、产品工艺控制、工艺参数控制、中间体控制等；终点控制，如通过原料药或制剂控制等。本研究中采用终点控制的策略。芬地柞酸左旋氯哌斯汀由左旋4－氯二苯甲醇与 N－（2－氯乙基）－哌啶盐酸盐反应制得左旋氯哌斯汀碱基，再与芬地柞酸成盐制得目标化合物，在合成过程中叔胺类物质可能引入仲胺杂质，另合成过程中使用的酰胺类溶剂在适宜条件下（如酸性、高温等）也可能产生仲胺，其与自然界常见的亚硝酸盐在酸性环境中可生成亚硝胺类化合物。推测这可能是本品中引入潜在亚硝胺类杂质的原因；此外，生产过程、包装材料或环境中也可能由污染引入亚硝胺类杂质，经过多批次样品的筛查，本品中均未检出NDMA 和NDEA，表明严格按当前合成工艺生产，本品被亚硝胺类物质污染的风险较小。

3.2 分析方法选择

N－亚硝胺类杂质的测定方法主要有GC－MS／MS法和液相色谱－串联质谱（LC － MS ／ MS）法［9－12］。LC － MS ／MS 法中，NDMA 出峰较早，峰形受溶剂强度影响较大，有机溶剂比例较高时，NDMA 色谱峰变形，灵敏度降低［13］；而芬地柞酸左旋氯哌斯汀在水中几乎不溶，LC－MS／MS 法灵敏度难以满足检测需求。故本研究中采用GC－MS／MS 法进行测定。

建立测定方法时，根据样品的溶解性，分别选用甲醇、乙腈和二氯甲烷为溶剂进行试验，结果以二氯甲烷作为溶剂时，待测化合物响应值约为另外两种溶剂的3 倍，故最终选择二氯甲烷为溶剂。

进样方式的选择，考虑到本品为原料药，成分较单一，直接进样可选择脉冲不分流模式，提高进样量，较顶空进样方式灵敏度更高［14］。另考虑到 N－亚硝胺类化合物是一系列含有相同官能团的化合物，相较单离子扫描方式，MRM 具有更强的专属性和灵敏度，能最大限度地避免假阳性结果。故最终选择直接进样、MRM 进行测定。