白皮杉醇抗恶性黑色素瘤的体内外实验研究

余波 刘伟 胡敏琪 唐休发 李春洁 阙林

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院头颈肿瘤外科，成都610041

恶性黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞且恶性程度极高的肿瘤，早期即可发生转移[1]，从全球数据来看，尽管其发病数仅占皮肤恶性肿瘤总数的5%，死亡例数却占皮肤癌的大部分[2]。其可发生于皮肤、黏膜、内脏等部位，特别是四肢极易摩擦部位[3]。目前，恶性黑色素瘤已经成为世界上发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3%～5%，我国每年新发病例约为2万例，恶性黑色素瘤患者死亡与新发病例的比例明显高于全球平均水平[4]。2020年，美国预计新增皮肤黑色素瘤100 350例，新增死亡6 850例[5]。对于美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期中0期、IA期、IB期的早期恶性黑色素瘤，首选的治疗方式依然为手术切除，选择做有足够安全范围的切除，可使患者具有良好的预后[6]。但是对于手术无法切除，或者发生多处转移而切除效果欠佳的晚期患者，则预后极差[7]，然而随着免疫治疗及靶向治疗的发展，比如常用的达拉菲尼联合曲美替尼针对具有BRAF V600E突变的病例[8]，伊马替尼针对具有KIT突变的病例[9]，抗细胞毒性T细胞淋巴细胞抗原4（ytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）及抗程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗体均取得了良好的效果[6,10]，其预后得到了一定的改善。有报道[11]称有远处转移的患者其中位生存期为6～12个月，5年生存率为5%，而另有报道[12]发现相应的中位生存期可达24个月。但是24个月的中位生存期并不能让人完全满意。另外多种药物只对相应的类型发挥效果，不能对所有恶性黑色素瘤产生治疗效果，如口腔恶性黑色素瘤[13]。再有该类治疗伴有不同程度的不良反应[14-15]，所以期望探索更多的治疗方式。

白皮杉醇（piceatannol，PIC）是白藜芦醇的类似物和代谢产物，是一种常见的天然二苯乙烯，广泛存在于葡萄、甘蔗、百香果、越橘属浆果、大黄、桂皮和大戟属植物等多种水果和植物中的化合物[16]，具有多种生物学功能[17]。近年来，PIC在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力等方面的作用越来越多地受到关注[18]。根据Du等[19]的研究，PIC可以促进miR-181a的表达，miR-181a通过抑制黑色素瘤细胞中的Bcl-2介导了促凋亡作用，提示PIC可能是治疗黑色素瘤的有效药物。但该研究并未对PIC是否对黑色素瘤其他功能具有作用及可能机制做进一步探讨。另一方面，PIC作为脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）的选择性抑制剂，能有效抑制Syk的磷酸化而发挥各种生物学作用，这可能也是PIC发挥肿瘤抑制功能的机制。故本实验拟通过体内外研究对PIC是否能抑制恶性黑色素瘤的其他功能以及其可能作用机制进行探究。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠（成都达硕生物科技有限公司），实验经过四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准（伦理号：WCHSIRB-D-2017-77），实验过程对动物的处置符合伦理学要求。

1.1.2 材料、器材和试剂 恶性黑色素瘤细胞系B16F10（由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供）。10%胎牛血清、DMEM/F12培养基、OPTI-MEM培养基（Gibco公司，美国），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒（上海碧云天生物技术公司），兔抗鼠Syk抗体、兔抗鼠磷酸化Syk抗体、兔抗鼠磷酸甘油醛脱氢 酶 （glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Affinity公司，美国），兔抗鼠基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗体、兔抗鼠MMP-9抗体、兔抗鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体（Santa Cruz公司，美国），羊抗兔二抗（SAB公司，美国），PIC（Selleck公司，美国），预染蛋白质相对分子质量标准液、Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen公司，美国），PureLink®RNA小量试剂盒（Life Technologies公司，日本），实时定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（TAKARA公司，日本），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（PALL公司，美国），CFX96实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测系统（Biorad公司，美国）。

1.2 细胞培养及分组

培养恶性黑色素瘤细胞系B16F10细胞时使用含有10%胎牛血清、双抗的DMEM/F12培养基。细胞培养于37℃，5%CO2恒温培养箱。细胞每隔2～3 d进行传代，选择处于对数生长期、生长状态佳的细胞用于实验。为了检查沉默Syk后B16F10细胞的侵袭及迁移能力，分组为：以siRNA-Syk转染细胞做siRNA实验组，NC作为对照组；为检查PIC对B16F10细胞活力的影响，以PIC溶于DMSO配置为浓度0、20、40、60、80、100μmol·L-1的溶液处理细胞做抑制剂实验组，以DMSO处理细胞作为对照组；为了检查PIC处理对B16F10细胞侵袭及迁移功能的影响及MMP-2、MMP-9、VEGF的表达变化，以PIC溶于DMSO配置为浓度10、20、30μmol·L-1的溶液处理细胞做抑制剂实验组，以DMSO处理细胞作为对照组。

1.3 小干扰RNA转染细胞

针对Syk基因序列设计siRNA。siRNA-Syk序列为5’-GAACUGGGCUCUGGUAAUU-3’，siRNA-NC为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。转染前1 d以每孔5×105个B16F10细胞接种于6孔板中，待细胞密度达30%～50%时进行转染。转染时配置A液将2×10-11mol siRNA溶于50μL OPTIMEM无血清培养基制成；B液将1μL Lipofectamine 2000溶于50μLOPTI-MEM无血清培养基，混匀室温静置5 min制成；将A、B混合为C，静置20 min；将C加入对应孔中。

1.4 蛋白印迹法测定蛋白表达水平

首先提取细胞蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒进行定量检测。蛋白样品中加入5×上样缓冲液，在100℃煮沸5 min。各上样孔加40μg蛋白样品，以10%的分离胶、5%的浓缩胶，在90 V恒压条件下电泳，染料移动到电泳槽的底部时停止电泳。200 mA置于冰浴中转膜1.5 h。把膜放在5%牛血清白蛋白中封闭1 h。PVDF膜放在一抗（MMP-2、MMP-9、VEGF、Syk、p-Syk抗体以5%BSA稀释）中，置于4℃孵育过夜。取出PVDF膜，TBST洗膜，二抗室温孵育1 h。电化学发光摄取图像。

1.5 MTT法检测细胞活力

将各组细胞以每毫升1×105个细胞的密度接种于96孔培养板中，设复孔5个，每孔加入细胞悬液100μL。第2日加入相应刺激。37℃培养24 h。每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4 h后小心吸去培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在570 nm处测量各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.6 RT-qPCR

PureLink®RNA小量试剂盒提取细胞mRNA，分光光度法测定RNA浓度后调平浓度，将mRNA逆转录为cDNA。使用CFX96实时定量PCR检测系统检测mRNA的表达量。引物由日本Life Technologies公司合成。Syk上游引物序列：5’-ACTTGGTCAGCGGGTGGAAT-3’，下游引物序列：5’-GGGTGCAAGTTCTGGCTCAT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列：5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。最后，用2-ΔΔCT统计学方法分析结果。

1.7 划痕实验

将各组细胞（每孔5×105个细胞）接种在6孔板上。当细胞密度达到90%时，用200μL枪头垂直背部横线划痕。然后用PBS洗3次，继续培养，分别于划痕的0、8 h观察并拍照测定细胞迁移能力。实验重复3次。

1.8 Transwell侵袭实验

检测各组细胞的侵袭能力。PBS清洗后使用胰酶消化细胞，离心弃去培养液，再使用无血清含1%双抗的DMEM/F12培养基制备为细胞悬液，将细胞接种于自带凝胶化Matrigel基质的上室，下室加入全营养DMEM/F12细胞培养液，37℃、5%CO2培养24 h后，抹去上室膜上表面细胞及Matrigel凝胶后，置于4℃冷室，用-20℃保存的甲醇固定10 min，吸弃固定液后，室温下0.5%结晶紫染色，双蒸水洗涤，显微镜下拍照，计数。

1.9 荷瘤小鼠实验

PBS清洗后使用胰酶消化B16F10细胞，置于冰上降低细胞代谢。选择生长状态良好，体重18～20 g的C57BL/6小鼠，小心剃去背部靠后毛发。将含2×106个细胞的细胞悬液注射入皮下。继续饲养并在第4、7、10天均分别以浓度为0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC，在第5、8、11、14天测量并计算肿瘤体积，第14天处死小鼠取出瘤体进行测量。

1.10 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准误表示，各组之间的比较使用方差分析进行，检验标准设置为α=0.05。

2 结果

2.1 PIC抑制B16F10的增殖、迁移及侵袭能力

对B16F10细胞使用浓度为0、20、40、60、80、100μmol·L-1的PIC溶液进行处理，经过MTT实验显示其细胞活力随浓度升高而降低，且差异具有统计学意义（P＜0.001）；Western blot结果显示PIC能够显著阻碍Syk的激活，PIC处理后B16-F10细胞的MMP-2、MMP-9、VEGF表达减少，且减少量与浓度呈正相关；划痕实验表明，PIC处理后细胞的迁移能力随PIC浓度升高而逐渐减弱，Transwell实验证明其侵袭能力也逐渐减弱（图1）。

图1 PIC处理使B16F10细胞活力、迁移侵袭能力下降Fig 1 Treating with PICdecreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.2 沉默Syk使B16F10细胞增殖、迁移和侵袭能力下降

si-Syk处理B16F10细胞，PCR验证了所选择的siRNA能够有效降低Syk的表达。MTT实验表明经si-Syk处理后的B16F10细胞增殖受到抑制，Western blot实验表明si-Syk组细胞中与肿瘤侵袭功能相关的MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达量较NC组下降，划痕实验表明si-Syk组细胞迁移能力较NC组减弱（图2）。

图2 小干扰RNA沉默Syk使B16F10细胞活力、迁移侵袭能力下降Fig 2 Silencing Syk by siRNA decreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.3 PIC抑制B16F10在小鼠体内成瘤能力

经过B16F10皮下注射构建荷瘤小鼠，在0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC后，其肿瘤进展受到显著抑制并且存在明显的剂量依赖作用（图3）。

图3 梯度浓度PIC处理小鼠对皮下成瘤的影响Fig 3 Effect of gradient concentration of PICon subcutaneoustumorigenesisin mice

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤，近年来，其发病率及死亡率逐渐增加，并呈年轻化趋势[20]。晚期恶性黑色素瘤的治疗有了更多的选择[21]。但是考虑到各种治疗的局限性[22]，应该积极探索新的药物及其作用机制。

PIC作为一种天然小分子化合物，拥有多种生物活性，已经被证实对多种肿瘤细胞，如前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭有一定的抑制作用[19,23]。本研究中，MTT检测结果发现PIC能抑制B16F10细胞活力；划痕实验和Transwell实验结果发现PIC能够抑制B16F10细胞迁移、侵袭能力，且强度与PIC浓度呈正相关。PIC处理后细胞中MMP-2、MMP-9、VEGF表达降低，且与PIC浓度呈正相关。MMP-2、MMP-9是一类蛋白水解酶，它们可以降解细胞外基质的多种成分，允许肿瘤扩散，促进肿瘤细胞侵袭[24]；VEGF则是具有促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用，可以增加血管通透性，促进细胞迁移[25]。

为了探究PIC作用的可能机制，首先通过Western blot实验，发现PIC处理的B16F10细胞内Syk蛋白表达水平下降，且磷酸化明显减少，验证了PIC对Syk的抑制作用。既往研究[26]认为，Syk主要在免疫信号转导方面发挥作用，是炎症反应中的重要分子。但是近年来发现了它的其他生物学功能，比如细胞黏附、免疫识别等。此外，又逐渐发现其在在不同类型的肿瘤中显示出促癌与抑癌两方面功能。通过RNA干扰沉默Syk后发现B16F10细胞的活力下降，迁移能力减弱，与细胞侵袭迁移功能相关的功能蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF的表达也相应的下降。这说明Syk在恶性黑色素瘤细胞的发展中起到促癌的作用。PIC可抑制Syk而对恶性黑色素瘤细胞发挥抑制作用。

为进一步研究PIC是否能在体内环境抑制恶性黑色素瘤，对小鼠腹腔注射B16F10细胞，从而成功构建了小鼠荷瘤模型，而后以PIC多次给药模拟给药过程。结果小鼠成瘤体积与PIC给药浓度呈负相关，这说明PIC对体内的肿瘤有抑制作用。

综上所述，本研究通过体内外实验，发现PIC能够在体外抑制恶性黑色素瘤细胞的迁移、侵袭等功能，在体内抑制恶性黑色素瘤的生长。PIC可能成为治疗皮肤恶性黑色素瘤的一种新选择。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。