CXC亚家族趋化因子配体10-受体3/CC亚家族趋化因子配体17-受体4轴在口腔扁平苔藓发病机制中的交互作用

唐楠 张雨垚 程珏华 赵知白 范媛

南京医科大学附属口腔医院口腔黏膜病科，江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏省口腔转化医学工程研究中心，南京210029

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种慢性炎症性口腔黏膜病，其病理特征是固有层密集淋巴细胞呈带状浸润，基底层液化变性[1-3]。OLP是一种T淋巴细胞介导的局部自身免疫性疾病[4]，虽然病因尚不清，但细胞免疫因素在发病机制中起着关键作用[5]。目前明确趋化因子与趋化因子受体结合可以调节抗原提呈、细胞因子产生以及效应T细胞和记忆T细胞的分化[6]，且二者在正常组织和炎症组织中决定免疫细胞和炎性介质转运方面存在差异表达[4]。

CXC亚家族趋化因子受体（CXC chemokine receptor，CXCR）3可与CXC亚家族趋化因子配体（CXCchemokine ligand，CXCL）9/10/11结合，介导辅助性T细胞（helper T cell，Th）1型疾病的发生[7]，如自身免疫性疾病[8]、超敏反应及界面皮炎等[7,9]。CC亚家族趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR）4是CC亚家族趋化因子配体（CC chemokine ligand，CCL）17和22的受体，主要调节Th2细胞相关的免疫过程如多发性硬化症（multiplesclerosis，MS）[10]。课题组[11-12]前期对CXCL10-CXCR3、CCL17-CCR4两个轴分别进行了研究，发现在OLP中两轴相关受体/配体均存在异常表达，但两轴间的相关互作关系尚不明确。故本研究通过收集OLP及健康者外周血对T淋巴细胞交叉干扰，检测两轴相关受体/配体的表达水平，进一步探讨两轴间的相互关系，从而为进一步阐明趋化因子及受体在OLP发病机制中的网络调控作用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料及试剂

磁珠、流式管、流式细胞检测仪（BD公司，美国），淋巴细胞分离液、EasySepTM人CD3阳性细胞分选试剂盒（Stemcell公司，加拿大），磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、RPMI 1640培养基、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美国），CXCR3（MCE公司，美国），CCR4拮抗剂（RD公司，美国），PE荧光标记的抗人CD3抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光标记的抗人CD4抗体、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光标记的抗人CD183（CXCR3）抗体、APC荧光标记的抗人CD194（CCR4）抗体；PE荧光标记的小鼠抗人CXCR3免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G1抗体和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）荧光标记的小鼠抗人IgG1抗体（Biolegend公司，美国），人趋化因子配体10、17双抗体夹心酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒（杭州市联科生物技术股份有限公司）。

1.2 试验样本

本研究招募2019年1—9月就诊于江苏省南京医科大学附属口腔医院口腔黏膜病科的受试者，40名OLP患者作为试验组，其中男16例，女24例，年龄（44.880±1.195）岁，20名健康者为对照组，其中男7例，女13例，年龄（44.500±2.516）岁。依据第4版《口腔黏膜病学》教科书、世界卫生组织和van der Meij等[13]提出的准则，根据OLP病损基部黏膜状况分型，分为糜烂型和非糜烂型各20例，其中糜烂型男7例，女13例，平均年龄（46.300±1.608）岁；非糜烂型男9例，女11例，平均年龄（43.450±1.749）岁。糜烂型为除白色病损外，线纹间及病损周围黏膜发生充血、糜烂、溃疡；非糜烂型为白色线纹间及病损周围黏膜正常，无充血、糜烂，黏膜上白色、灰白色线状花纹组成网状、环状、斑块、水疱多种病损。试验组与对照组的性别和年龄差异无统计学意义，所有受试者的年龄范围均在18～70岁之间。OLP患者的病程为1个月～1年不等，临床和组织病理学诊断标准符合世界卫生组织和van der Meij等[13]提出的准则。排除标准：1）患其他已确定的口腔黏膜疾病；2）有较严重的系统性疾病、肿瘤；3）1个月内使用过抗生素、3个月内使用过免疫制剂；4）某些药物或银汞合金充填物可能引起苔藓样反应；5）严重嗜烟、嗜酒。健康受试者纳入条件为无全身疾病、无口腔黏膜病、3个月内未服用抗生素、免疫抑制剂[13-14]。该研究获南京医科大学伦理学委员会批准，批准号：南医大伦审（2014）132号。

1.3 外周血T细胞分离和鉴定

将收集的静脉血密度梯度离心分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），离心后PBS洗2次弃上清液，抗CD3抗体包被、CD3磁珠分选T细胞，选取一定量细胞加入PE标记的抗人CD3流式抗体，4℃避光环境下孵育30 min，并设置未加抗体的细胞混悬液为阴性对照组，流式细胞仪上机检测，然后剩余细胞放于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育。

1.4 拮抗剂与T细胞共培养

取出细胞，1 000 r·min-1、4 min离心后弃上清，记录细胞数，加入T细胞培养液并等量分至24孔板的3孔中，分别为空白组（不加拮抗剂）、拮抗CXCR3组（加入CXCR3拮抗剂）、拮抗CCR4组（加入CCR4拮抗剂）。最后将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

1.5 流式细胞术实验

取出培养的细胞离心并将上清液留存至-80℃冰箱中，待后续生物素双抗体夹心ELISA实验使用。PBS洗涤流式管2次并设置空白、拮抗CXCR3、拮抗CCR4三组各自的同型对照组。6个流式管中均加入FITC荧光标记的抗人CD4流式抗体，得以分选出Th细胞。试验组分别加入PE标记的抗人抗体CXCR3和APC标记的抗人抗体CCR4；同型对照组3管中分别加入PE标记的小鼠抗人CXCR3 IgG1抗体和APC标记的小鼠抗人IgG1抗体。4℃避光环境下孵育30 min，PBS洗2次弃上清液，1%的多聚甲醛固定细胞，流式细胞仪上机检测。

1.6 ELISA检测

根据人CXCL10、CCL17ELISA试剂盒说明书分别测定细胞培养上清液中CXCL10、CCL17的水平变化，每组设3个副孔。试剂盒中针对CXCL10、CCL17的单克隆抗体已预先在试剂盒中的96孔滴度板中，标准样品和生物素结合检测抗体特异性CXCL10、CCL17的试剂依次被加入孔中。孵育、洗涤，最后加入显色液和终止液，酶标仪上机分别检测记录在450 nm和630 nm波长下的读数。

2 结果

2.1 CD3+T淋巴细胞纯度鉴定结果

健康对照者CD3+T淋巴细胞纯度为95.500 0%±1.063 0%，OLP患者中非糜烂型为96.200 0%±0.989 4%，糜烂型为96.080 0%±0.281 8%。各组T细胞纯度均＞95%，且差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 流式细胞术检测外周血T细胞表面受体CXCR3的表达

OLP患者较健康对照者，各组CXCR3表达均增强。OLP中，拮抗CXCR3组较空白组，CXCR3表达下调（P＞0.05）；拮抗CCR4组较空白组，CXCR3表达上调（P＞0.05）（图1）。健康对照者变化与OLP患者一致，拮抗组较空白组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。将OLP患者和健康对照者的CXCR3表达结果比较，空白组、拮抗CXCR3及CCR4组的差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 OLP患者和正常人外周血T淋巴细胞中CXCR3+T细胞的表达水平Tab 1 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients and controls

图1 OLP患者外周血T淋巴细胞中CXCR3+T细胞的表达水平Fig 1 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients

图2 健康对照者外周血T淋巴细胞中CXCR3+T细胞的表达水平Fig 2 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of controls

2.3 流式细胞术检测外周血T细胞表面受体CCR4的表达

OLP患者较健康对照者，各组CCR4表达均增强。OLP中，拮抗CXCR3组较空白组，CCR4表达下调（P＞0.05）；拮抗CCR4组较空白组，CCR4表达显著下调（P＜0.05）（图3）。健康对照者趋势与OLP患者一致，但拮抗组较空白组差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。将OLP患者和健康对照者的CCR4表达结果比较，空白组与拮抗CXCR3、CCR4组差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

图3 OLP患者外周血T淋巴细胞中CCR4+T细胞的表达水平 Fig 3 Expression of CCR4+T cellsin peripheral blood T lym- phocytes of OLPpatients

图4 健康对照者外周血T淋巴细胞中CCR4+T细胞的表达水平Fig 4 Expression of CCR4+T cellsin peripheral blood T lym-phocytes of controls

表2 OLP患者和健康对照者外周血T淋巴细胞中CCR4+T细胞的表达水平Tab 2 Expression of CCR4+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients and controls

2.4 ELISA检测细胞上清液中趋化因子CXCL10的表达

OLP患者较健康对照者，各组CXCL10表达均增强。OLP中，拮抗CXCR3组较空白组，CXCL10表达显著下调（P＜0.05）；拮抗CCR4组较空白组，CXCL10表达上调（P＞0.05）（图5）。健康对照者趋势与OLP患者一致，但拮抗组较空白组均差异无统计学意义（P＞0.05）（图6）。将OLP患者和健康对照者的CXCL10结果比较，空白组、拮抗CCR4组差异有统计学意义（P＜0.05），而拮抗CXCR3组差异无统计学意义（P＞0.05）。而将OLP中的非糜烂组和糜烂组分别与健康对照比较均差异无统计学意义（表3）。

表3 OLP患者和健康对照者外周血T淋巴细胞上清液中CXCL10的表达水平Tab 3 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients and controls

图5 OLP患者外周血T淋巴细胞上清液中CXCL10的表达水平Fig 5 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients

图6 健康对照者外周血中T淋巴细胞上清液中CXCL10的表达水平Fig 6 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of controls

2.5 ELISA检测细胞上清液中趋化因子CCL17的表达

OLP患者较健康对照者，各组CCL17表达均增强。OLP中，拮抗CXCR3组较空白组，CCL17表达下调（P＞0.05）；拮抗CCR4组较空白组，CCL17表达显著下调（P＜0.05）（图7）。健康对照者各组间差异无统计学意义（P＞0.05）（图8）。将OLP患者和健康对照者的CCL17表达结果比较，空白组的差异有统计学意义（P＜0.05），而拮抗CXCR3、CCR4组的差异无统计学意义。而非糜烂组和糜烂组分别与健康对照比较的差异均无统计学意义（表4）。

图7 OLP患者外周血T淋巴细胞上清液中CCL17的表达水平Fig 7 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes inperipheral blood of OLPpatients

图8 健康对照者外周血中T淋巴细胞上清液中CCL17的表达水平Fig 8 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of controls

表4 OLP患者和健康对照者外周血T淋巴细胞上清液中CCL17的表达水平Tab 4 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients and controls

3 讨论

研究[15]表明，趋化因子网络系统中含有丰富的配体和受体，许多趋化因子及其受体可以作为治疗自身免疫性疾病的有效靶点。趋化因子发出趋化信号招募T细胞，并在机体稳态或自身免疫性炎症时适当调整T细胞的迁移，但在自身免疫过程中具体如何打破免疫耐受诱发炎症尚不清。CXCR3、CCR4分别是Th1、Th2细胞的特征性趋化因子受体[16]，课题组[11-12]前期也分别对CXCL10-CXCR3、CCL17-CCR4单个轴在OLP发病机制中的作用进行了验证，发现在OLP外周血中，CXCR3、CCR4、CXCL10、CCL17这4个指标均较正常人高表达。但具体趋化因子及受体之间有无相互作用尚不清楚，故本研究尝试探究两轴间的相关互作，从而为进一步阐明趋化因子及受体在OLP发病机制中的网络调控作用提供实验依据。

本研究发现，拮抗CCR4后，CXCR3表达上调。有文献[17]报道称，在慢性结核病中，CCR4缺失可加重肺部Th1炎症和感染细菌进入肺部，并发现在CCR4先天缺陷的小鼠中，参与Th1细胞募集的相关趋化因子受体CXCR3、CCR5的基因表达均增加，CCR4的缺陷造成经由CXCR3和CCR5被招募到肺部的Th1细胞增多，加重Th1型炎症反应。这与本实验结果相符，由此笔者推测，CCR4对CXCR3可能存在一种负反馈调节。

本研究拮抗CXCR3后，CCR4表达下调。有研究[18]发现在干燥综合征中，CXCR3及CXCL10与该病早期发生有关，CCR4及CCL17/CCL22与该病发展进程相关。有关慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease，cGVHD）的研究[19]也提出，CXCR3或CCR5与CXCL10的相互作用可能在Th1细胞迁移以及cGVHD的启动中发挥重要作用，CCR4则与配体相互作用募集了Th2细胞并参与cGVHD的发展，这提示从CXCR3上调到CCR4上调可能是一个单向有序的递进过程，CXCR3上调达到一定水平诱发疾病发生，之后与疾病发展进程相关的CCR4上调，因此CXCR3对CCR4可能具有正向调节作用。

本研究中各组OLP患者的CXCR3、CCR4表达均较正常人上调，课题组前期研究[12]发现，在OLP患者外周血中，Th2型反应占主导。但Th1型受体CXCR3的表达增强提示，其可能并非CXCR3或CCR4单一调节OLP的炎症过程，而是二者共同促成OLP的发病。有文献[15]报道称，在以Th2型反应为主导的特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）的炎症部位Th2、Th1信号均显著表达，研究者[15]认为这可能是因为特应性皮炎患者皮肤屏障受损，多种抗原穿透皮肤从而引发AD的混合炎症反应。此外，硬皮病（也称为系统性硬化症）炎症性纤维化的出现也可能与混合炎症的存在有关。结合课题组以往研究及本研究结果，关于CXCR3-CXCL10及CCR4-CCL17轴在OLP发病中的作用机制如图9所示。

图9 CXCL10-CXCR3轴和CCL17-CCR4轴在口腔扁平苔藓发病机制中的作用机制Fig 9 The mechanism of CXCL10-CXCR3 axisand CCL17-CCR4 axisin thepathogenesisof oral Lichen planus

在OLP患者外周血的局部免疫应答环境中，趋化因子CXCL10、CCL17发出趋化信号招募总的T淋巴细胞至炎症部位，并与分化为Th1、Th2型的T细胞表面的特征性受体即CXCR3、CCR4相结合。本研究推测，CXCR3对CCR4可能具有正向调节作用，而CCR4对CXCR3可能存在一种负反馈调节。CXCR3增多是CCR4增多的基础，而当CCR4表达增强到一定程度时，CCR4则会向CXCR3发出负反馈信号，CXCR3与CCR4之间借此维持相对平衡，这一点也可能与OLP病程的慢性迁延不愈有关。趋化因子受体CXCR3、CCR4及其配体CXCL10、CXCL17的表达均增强，笔者认为在OLP的发病机制中，可能存在CXCR3、CCR4相互影响并介导的Th1、Th2型的混合炎症反应。炎症微环境中CXCR3-CXCL10、CCR4-CCL17轴发挥效应，促使Th1和Th2型细胞分泌更多的炎性因子，炎性因子再招募更多的T细胞，共同形成混合炎症的正反馈循环，协同推进OLP的发展。

本研究拮抗CXCR3后，CCL17表达下调；拮抗CCR4后，CXCL10表达上调。趋化因子CXCL10、CCL17的变化趋势和相应受体一致。但在配体结果中，总OLP组较对照组有差异，非糜烂组和糜烂组分别比较时则差异无统计学意义。分析原因可能是由于趋化因子受体往往存在多个配体，CXCR3的配体有CXCL9/10/11，CCR4的配体为CCL17/22[7,10]。OLP的临床分型依据炎症严重程度的不同可分为糜烂型和非糜烂型，其产生炎症的过程可能是多个配体参与，或者同一趋化因子受体在OLP局部免疫反应的不同阶段与不同的配体发生结合，受体与配体发挥效应共同推进炎症的发展。故推测CXCL10和CCL17虽在OLP中异常表达，但作为OLP的临床分型指标不够灵敏，受体CXCR3、CCR4可能作为评价OLP疾病炎症程度和临床分型的指标更为准确。

综上所述，在OLP发病机制中CXCR3对于CCR4可能存在一种正反馈调节机制，CXCR3与CCR4协同作用诱发OLP的混合炎症反应。此外，体外实验表明，CCR4对于CXCR3也可能存在负反馈调节作用。趋化因子受体CXCR3、CCR4作为评价OLP临床分型的指标较其配体CXCL10、CCL17可能更为准确。通过本研究提示，CXCL10-CXCR3轴、CCL17-CCR4轴可能在趋化因子与趋化因子受体的相互作用中扮演不同角色，彼此影响并协同推进OLP疾病的发生和发展。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。