益心泰醇提物对血管紧张素Ⅱ诱导的兔心肌成纤维细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

唐云，郭志华，张彤瑜，龙云，李雅

益心泰醇提物对血管紧张素Ⅱ诱导的兔心肌成纤维细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

唐云1，郭志华2，张彤瑜1，龙云1，李雅3

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医学院湖南 长沙 410208； 3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 4 10208

观察益心泰醇提物对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的兔心肌成纤维细胞（CFs）Bax和Bcl-2蛋白表达的影响，探讨其抗心肌纤维化的作用机制。提取新生兔CFs，细胞分为对照组、模型组、氯沙坦钾组和益心泰醇提物低、中、高剂量组。除对照组外，其余各组细胞予AngⅡ处理12 h建立心肌纤维化模型，再加入相应浓度药物培养一定时间，对照组加入不含AngⅡ和药物的培养基培养，CCK-8法检测CFs细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。与对照组比较，模型组CFs细胞活力明显升高，Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高，细胞凋亡率显著降低（＜0.01）；与模型组比较，益心泰醇提物低、中、高剂量组CFs细胞活力明显降低，Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低（＜0.05，＜0.01），益心泰醇提物中、高剂量组细胞凋亡率明显升高（＜0.05，＜0.01）。益心泰醇提物可抑制AngⅡ诱导的心肌纤维化，其机制可能与抑制CFs增殖、降低细胞活力和Bcl-2蛋白表达、升高Bax蛋白表达、促进CFs凋亡有关。

益心泰醇提取物；心肌成纤维细胞；血管紧张素Ⅱ；细胞凋亡；兔

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）时胶原纤维过度沉积，导致正常心肌细胞活动受限，心室壁僵硬，心脏收缩力减弱，心功能下降，可使心肌组织电活动异常并加速心肌组织坏死。MF可发生于多种心血管疾病，是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，也是终末期心力衰竭的主要因素[1-2]。因此，对MF进行干预尤为重要。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与MF密切相关，研究表明，AngⅡ可促进心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）增殖与分化，使CFs纤维化[3]。MF病理机制复杂，目前研究显示，CFs凋亡异常是其重要机制之一[4]。Bcl-2家族蛋白主要参与细胞凋亡的调控，且广泛存在于心肌细胞中，主要有抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax。当二者比值降低时，可诱导心肌细胞凋亡[5]。慢性心力衰竭属本虚标实之证，其病机可概括为虚、瘀、水[6]，其虚以气虚为主。益心泰是本课题组根据多年临床经验总结的经验方，动物实验显示，益心泰能改善慢性心力衰竭大鼠和兔心室重构，提高心脏功能[7-9]。本研究采用AngⅡ诱导CFs作为研究对象，观察益心泰醇提取物对CFs Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，探讨其抗MF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

普通级新西兰兔60只，雌雄各半，体质量40～100 g，购于湖南太平生物科技有限公司，动物质量合格证号43608300000677，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。本实验经湖南中医药大学动物实验伦理委员会审查批准（LL201810801）。

1.2 药物及制备

益心泰由黄芪、丹参、红花、泽泻、猪苓按3∶1.5∶1∶1∶1比例组成，饮片购自昌都振兴中药饮片实业有限公司，所有饮片混匀后加入8倍量70%乙醇回流提取120 min，再加入6倍量70%乙醇回流提取90 min，合并提取液，过滤，减压浓缩，于105 ℃真空干燥3 h，制备益心泰醇提物干粉，相当于含原药材3.67 g/g干粉。氯沙坦钾片，杭州默沙东制药有限公司，批号20171020，50 mg/片。

1.3 主要试剂与仪器

0.25%胰蛋白酶消化液，美国Thermo Fisher Scientific，货号25200056；DMEM培养基，美国Hyclone，批号SH30022.01B；胎牛血清（FBS），美国Gibco，批号10270-106；波形蛋白抗体，上海联迈，货号LM-0756R；AngⅡ，广州威佳，货号A9525；CCK8试剂盒，苏州瑞诺德，货号CK04；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天，货号C1062S；羊抗兔二抗，美国Thermo Fisher Scientific，货号G21234；羊抗鼠二抗，美国Thermo Fisher Scientific，货号G21040；蛋白Marker，北京全氏金，货号DM111-01；Bax抗体，美国CST，货号2772S；Bcl-2抗体，美国CST公司，货号2762S；GAPDH抗体，英国Abcam公司，货号ab181602。倒置显微镜（日本Olympus公司，BX51），分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000），流式细胞仪（美国BD，FACSCalibur），热电酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific，MK3），凝胶成像系统（上海天能，Tanon 1600）。

1.4 心肌成纤维细胞培养及纯度鉴定

取新生1～3 d新西兰兔，分离心脏，取左心室心尖组织，PBS清洗，切成1 mm3小块；加入10倍体积0.25%胰蛋白酶消化液，吹打分散细胞，置于37 ℃水浴中消化5 min，自然沉淀，弃上清液，加0.25%胰蛋白酶消化液，吹打均匀，37 ℃消化5 min，自然沉淀，取上清液，800 r/min离心10 min，弃上清液，加入含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞；未消化的组织继续消化，重复上述步骤5次。收集细胞悬液，吹打均匀后过滤，置于培养皿中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养1 h，采用差速贴壁法，倒出培养液，加入新鲜的含10%FBS的DMEM培养基培养，2～3 d传代1次，采用2～4代细胞进行实验。倒置显微镜下观察，免疫组化检测波形蛋白阳性表达，计算CFs纯度（90%以上）。

1.5 分组及干预

CFs分为对照组、模型组、氯沙坦钾组（600 mg/L）和益心泰醇提物低（50 mg/L）、中（100 mg/L）、高（200 mg/L）剂量组，除对照组外，其余各组细胞予10-7mol/L AngⅡ处理12 h，再加入对应浓度药物培养一定时间，对照组加入不含AngⅡ和药物的培养基培养。倒置显微镜观察细胞形态。

1.6 细胞活力检测

将细胞以2×103个/孔接种至96孔板，按“1.5”项下方法处理，加入对应浓度药物培养4 d，每孔加10 μL CCK8溶液，于酶标仪波长450 nm处测定各孔OD值。

1.7 细胞凋亡率检测

将细胞密度调整为1×105个/mL，接种于6孔板，按“1.5”项下方法处理细胞，加入对应浓度药物培养48 h，用不含EDTA胰蛋白酶消化细胞，2 000 r/min离心5 min，预冷的PBS洗涤细胞，离心，弃上清，加300 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，置于Falcon试管中，加5 μL Annexin V-FITC，室温避光孵育15 min，加5 μL碘化丙啶染色，流式细胞仪测定，FlowJo流式分析软件进行数据分析。

1.8 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达

将细胞密度调整为1×105个/mL，接种于10 cm培养皿中，按“1.5”项下条件处理细胞，加入对应浓度药物培养48 h，弃去培养液，预冷的PBS洗涤细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，上样，80 V电泳15 min，调整电压至120 V，直至溴酚蓝到达分离胶底部，200 mA转膜2 h，加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育45 min，经凝胶成像系统成像，Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH为内参，计算Bax、Bcl-2蛋白条带灰度值与内参的比值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 益心泰醇提物对模型细胞形态的影响

对照组CFs形状不规则，细胞胞体、胞核大小正常，无自主搏动；模型组CFs增殖明显，呈融合状态，细胞胞体、胞核体积增大；各给药组CFs数量、细胞胞体体积、细胞周围纤维状丝均有不同程度减少，氯沙坦钾组和益心泰醇提物高剂量组最明显。见图1。

2.2 益心泰醇提物对模型细胞活力的影响

与对照组比较，模型组CFs细胞活力显著升高（＜0.01）；与模型组比较，各给药组CFs细胞活力明显降低（＜0.05，＜0.01）。见表1。

图1 各组CFs形态观察

表1 各组CFs细胞活力比较（±s）

注：与对照组比较，##＜0.01；与模型组比较，*＜0.05，**＜0.01

2.3 益心泰醇提物对模型细胞凋亡率的影响

与对照组比较，模型组CFs凋亡率明显降低（＜0.01）；与模型组比较，益心泰醇提物中、高剂量组和氯沙坦钾组CFs凋亡率明显升高（＜0.05，＜0.01）。见表2、图2。

表2 各组CFs凋亡率比较（）

注：与对照组比较，##＜0.01；与模型组比较，*＜0.05，**＜0.01

图2 各组CFs凋亡率流式细胞图

2.4 益心泰醇提物对模型细胞Bax、Bcl-2表达的影响

与对照组比较，模型组CFs Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，各给药组CFs Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低（＜0.05，＜0.01）。见表3、图3。

表3 各组CFs Bax、Bcl-2蛋白表达比较（）

模型组 50.288±0.091##3.432±1.139## 益心泰醇提物低剂量组 5050.425±0.143*2.658±1.346* 益心泰醇提物中剂量组10050.697±0.179**2.247±0. 965** 益心泰醇提物高剂量组20050.752±0.143**1.464±0.307** 氯沙坦钾组60050.869±0.212**0.955±0.413**

注：与对照组比较，##＜0.01；与模型组比较，*＜0.05，**＜0.01

注：A.对照组；B.模型组；C.益心泰醇提物低剂量组；D.益心泰醇提物中剂量组；E.益心泰醇提物高剂量组；F.氯沙坦钾组

图3 各组CFs Bax、Bcl-2蛋白免疫印迹图

3 讨论

MF是指心肌组织中CFs过度增殖，使细胞外基质中胶原纤维、胶原蛋白等过度沉积。CFs约占心脏组织的2/3，是非心肌细胞的主要组成部分，也是合成细胞外基质的细胞。CFs活化是评价MF的重要指标，活化后的CFs向肌成纤维细胞转化，导致心室重构、心脏肌肉僵硬，影响心脏功能，最后发展为心力衰竭[10]。

本实验结果显示，模型组CFs增殖明显，细胞呈融合状态，部分细胞周围有纤维状丝，细胞胞体、胞核体积增大，细胞活力升高，Bax表达显著降低， Bcl-2表达显著升高，细胞凋亡率显著下降，表明AngⅡ可促进CFs增殖，提高细胞活力，抑制细胞凋亡。与模型组比较，益心泰醇提物各剂量组CFs细胞活力明显降低，Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显降低，益心泰醇提物中、高剂量组CFs凋亡率有所升高，表明益心泰醇提物可抑制CFs增殖，降低细胞活力，升高Bax表达，降低Bcl-2表达，促进细胞凋亡。

益心泰有益气温阳、活血利水功效，方中黄芪为君药，丹参为臣药。研究表明，黄芪主要有效成分黄芪甲苷可降低心肌梗死大鼠心肌组织胶原容积分数和左心室质量指数，提高射血分数，改善心室重构，延缓心肌纤维化[11]。心肌缺血再灌注时内质网过度应激，激活凋亡信号通路，黄芪甲苷可介导内质网应激，减轻细胞损伤，抑制心肌细胞凋亡[12]。丹参主要有效成分丹参酮ⅡA可调节凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-12和Caspase-3的水平，降低左室舒张末期容积、左室收缩末期容积，提高左室射血分数，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心室重构，提高心功能[13]。

综上，益心泰醇提物可抑制AngⅡ诱导的MF，其机制可能与抑制CFs增殖、降低细胞活力和Bcl-2蛋白表达、升高Bax蛋白表达、促进CFs凋亡有关。

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Effects ofAlcohol Extract on Expressions of Bax and Bcl-2 Protein in Angiotensin Ⅱ-induced Cardiac Fibroblasts in Rabbits

TANG Yun1, GUO Zhihua2, ZHANG Tongyu1, LONG Yun1, LI Ya3

To observe the effects ofalcohol extract on the expressions of Bax and Bcl-2 protein in angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induced cardiac fibroblasts (CFs) in rabbits; To explore the mechanism of anti-myocardial fibrosis ofalcohol extract.The CFs of newborn rabbits were extracted, and the cells were divided into control group, model group, Losartan potassium groupandalcohol extract low-, medium-, high-dosage groups. Except for the control group, cells in other groups were treated with Ang Ⅱ for 12 h to establish a myocardial fibrosis model, and then added with the corresponding concentration of drugs for a certain period of time. The control group was cultured with medium without Ang Ⅱ or drugs. CCK-8 method was used to detect cell viability, flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate, and Western blot was used to detect expressions of Bax and Bcl-2 protein.Compared with the control group, the cell viability of CFs in the model group increased, the expression of Bax protein significantly decreased, the expression of Bcl-2 protein significantly increased, and the apoptosis rate significantly decreased (<0.01). Compared with the model group, the cell viability of CFs inalcohol extract low-, medium-, and high-dosage groups was significantly reduced, the expression of Bax protein significantly increased, and the expression of Bcl-2 protein significantly decreased (<0.05,<0.01); apoptosis rate of CFs inalcohol extract medium- and high-dosage groups significantly increased (<0.05,<0.01).alcohol extract can inhibit AngⅡ-induced myocardial fibrosis, and its mechanism may be related to inhibiting CFs proliferation, reducing cell viability and Bcl-2 protein expression, increasing Bax protein expression, and promoting CFs apoptosis.

alcohol extract; cardiac fibroblasts; angiotensin Ⅱ; cell poptosis; rabbits

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0083-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012520

国家自然科学基金（81673955）；重大疑难疾病慢性心力衰竭中西医临床协作试点项目（2018年）；湖南省卫生计生科研计划（20200592、20180710）；湖南中医药大学中医学一流学科开放基金（2018ZYX43）；湖南中医药大学中医学国内一流建设学科（2018年）；湖南省科技计划（2018JJ2304）

李雅，E-mail：liya112@163.com

（收稿日期：2020-12-29）

（修回日期：2021-01-14；编辑：华强）