肿瘤坏死因子-α诱导对膀胱癌细胞株NF-κB信号通路分子表达及细胞增殖水平的影响*

路 蔓，付 强，张 静△

空军军医大学第二附属医院：1.检验科；2.泌尿外科，陕西西安 710038

目前，越来越多的研究证实，恶性肿瘤的发生与炎症密切相关[1]。膀胱癌患者普遍存在炎性反应，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种常见的炎性反应指标，有研究表明TNF-α水平与恶性肿瘤的进展相关[2]。有研究发现，在肝细胞肝癌、前列腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤中，核因子-κB(NF-κB)信号通路存在异常激活的现象，并且该因子直接影响着炎症与癌症的关系[3]。本研究拟了解TNF-α诱导对膀胱癌细胞NF-κB通路分子表达及细胞增殖水平的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 人膀胱癌细胞2株，即T24和5637，均统一由中科院广州研究所提供。

1.2仪器与试剂 酶标仪(Bio-Rad 680，美国伯乐公司)；实时荧光PCR仪(ABI 7500，德国Eppendorf公司)；RPMI 1640培养基(批号：8114641，上海信帆生物科研所)；胎牛血清(批号：56H4627，上海江林生物科技有限公司)；重组人TNF-α试剂(批号：CYT-233-a，默克生命科学)；CCK-8试剂盒(批号：WZ736，上海酶联生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1培养并处理膀胱癌细胞 选取人膀胱癌细胞株T24和5637，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养，在37.5 ℃、5%二氧化碳(CO2)条件下培养至对数生长期。观察培养的情况，待以一定浓度铺板生长后，对T24和5637进行处理。需要注意的是，在处理之前必须要同步化处理，具体操作要求为使用无胎牛血清培养液进行饥饿处理。根据不同的处理方法，分为两组，TNF-α处理组采用50 ng/mL TNF-α处理，对照组采用同等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)处理。

1.3.2实时荧光定量PCR检测 将对数生长期的细胞株，以(2～3)×107/mL的水平接种于24孔板中，同步化处理之后，将细胞分成3个不同的组，每组设置3个复孔，且独立重复3次。采用TNF-α分别作用1、3、6 h，然后进行细胞的收集。提取细胞总RNA的方法为Trizol法，反转录合成cDNA备用。实时荧光定量PCR反应体系参照文献[4]操作进行。各基因的检测结果按2-ΔΔCt方法计算。

1.3.3癌细胞增殖活性的检测 采用CCK-8法对膀胱癌细胞(T24、5637)的增殖活性进行检测：取对数生长期的细胞，以(1～2)×107/L的水平将其接种于细胞培养液(96孔)中，使用含10%胎牛血清的1640培养液进行常规培养，持续24 h。同步化处理：处理完成之后，设置TNF-α处理组和对照组，每孔设置5个复孔，独立重复5次。处理24 h，检测膀胱癌细胞的增殖活性，检测时严格参照CCK-8试剂盒要求和说明进行操作。需要注意的是，为提高检测的质量，在检测前应更换培养液，每孔加入100 μL培养液和10 μL的CCK-8试剂，继续培养2 h。采用酶标仪对450 nm波长处各孔的吸光度进行检测，并计算细胞存活率。按照以下方法计算细胞存活率：细胞存活率=(A处理组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)×100%。

1.4观察指标 分析TNF-α处理对不同膀胱癌细胞株NF-κB信号通路中RelA、RelB两种基因表达的影响。比较TNF-α处理对不同膀胱癌细胞株细胞增殖能力的影响。

2 结 果

2.1TNF-α对膀胱癌T24细胞株NF-κB信号通路的影响 TNF-α处理T24细胞株后，TNF-α处理组的RelA、RelB基因表达水平均高于对照组(P<0.05)，且TNF-α处理后，不同时间RelA、RelB基因表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，随着时间的延长基因表达水平不断上升。见表1。

表1 TNF-α对膀胱癌T24细胞株NF-κB信号通路的影响

2.2TNF-α对膀胱癌5637细胞株NF-κB信号通路的影响 TNF-α处理5637细胞株后，RelA基因表达水平在作用3 h后明显上升，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，但是RelB基因表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 TNF-α对膀胱癌5637细胞株NF-κB信号通路的影响

2.3TNF-α处理对不同膀胱癌细胞株增殖活性的影响 膀胱癌细胞株T24和5367经TNF-α处理后，对照组、TNF-α处理组的细胞存活率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组不同膀胱癌细胞株细胞存活率的比较

3 讨 论

根治性膀胱全切除术是膀胱癌治疗的重要手段，科学、合理地制订手术方案，将病灶予以切除，有利于提高患者的生存质量，延长患者的生存期[5]。但是，对于膀胱癌的根治性手术治疗，必须要建立在对该恶性肿瘤全面了解的基础上，以便能够最大限度地提高治疗水平，满足患者的治疗需求。因此，有必要加强对膀胱癌发病机制、原因的分析。

随着临床对膀胱癌研究的不断深入，人们发现炎性反应与其发生、发展密切相关[6]。研究表明，在肿瘤微环境中，经常能够检测到高水平的炎性细胞因子或缺氧现象的存在，而细胞因子和缺氧应激均是NF-κB信号通路激活的刺激物，NF-κB信号是连接炎症与肿瘤的关键通路之一[4,7]。TNF-α是重要的促炎细胞因子，高度参与了相关炎性反应，并且也参与了NF-κB信号通路的激活，从而“嫁接”起NF-κB信号通路和恶性肿瘤，使二者保持密切联系[8-10]。为此，本研究以膀胱癌细胞株T24和5637为研究对象，对TNF-α这一促炎因子对NF-κB信号通路的影响展开分析。本研究结果显示，TNF-α处理T24细胞株后RelA基因的表达水平均有所上调，而5637细胞株在处理3 h后有明显上升(P<0.05)。但RelB基因的表达与RelA基因不同，在TNF-α作用1 h后显著上调，可仅局限于T24细胞株，5637细胞株在各作用时间点均无明显变化(P>0.05)。进一步分析发现，在TNF-α作用时间不断延长的情况下，T24细胞株RelB基因的表达上调幅度逐渐下降，这一结果提示TNF-α对NF-κB信号的非经典通路可能存在负反馈调节机制来维持微环境的稳定[2,10-11]。需要注意的是，TNF-α在作用6 h后，T24细胞株的RelB基因表达水平上调，5367细胞株的RelB基因表达水平则下调。由此可以看出，TNF-α作用前后的2个信号通路基因表达水平改变并不是完全一致，这在很大程度上表明了TNF-α对NF-κB信号的经典和非经典通路的作用机制具有选择性，作用的过程可能不同。分析TNF-α处理对膀胱癌细胞增殖活性的影响，结果显示无论是作用于T24细胞株还是5367细胞株，差异均无统计学意义(P>0.05)，因此从这一结果可以认为TNF-α可能对膀胱癌细胞株的增殖活性无较大影响。

综上所述，TNF-α可诱导膀胱癌细胞NF-κB信号通路RelA、RelB基因的表达，并且主要作用于早期阶段，但对细胞株增殖活性的影响甚微。