浙江省金华市中华蜜蜂线粒体DNA遗传多样性研究

曹联飞，苏晓玲，陈道印，赵东绪，华启云

(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；2. 金华市农业科学研究院，浙江金华 321000)

中华蜜蜂Apisceranacerana，即中蜂，是中国境内东方蜜蜂Apiscerana的总称，广泛分布于除新疆以外的全国各地，特别是南方的丘陵、山区(国家畜禽遗传资源委员会, 2011)。中蜂适合山区定地饲养，善于采集零星蜜源，抗逆能力强，在我国具有悠久的饲养历史，已被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。近年来，国家非常重视中蜂的遗传资源保护工作，建立了多个保种场和保护区。浙江是中蜂的传统分布区，近几年中蜂养殖发展迅猛，已由2013年的10多万群增长到2018年的40多万群(施金虎等, 2019)。

遗传多样性研究是中蜂资源有效保护和合理开发利用的基础。传统上我国中蜂可划分为北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、海南中蜂、阿坝中蜂、滇南中蜂和西藏中蜂等9个类型(国家畜禽遗传资源委员会, 2011)。近些年来，线粒体分子标记在我国中蜂的遗传多样性研究中大量应用。姜玉锁等(2007)利用线粒体分子标记研究发现我国境内不同地理型中蜂存在着较明显的遗传分化。周姝婧等(2016)利用线粒体分子标记对福建省的中蜂研究发现遗传分化不明显。李彪等(2018)和王俊杰等(2018)分别利用线粒体分子标记研究发现四川唐家河国家级自然保护区和陕西秦巴山区的中蜂遗传多样性丰富。关于浙江省中蜂的遗传多样性研究，赵东绪等(2013)利用形态学特征研究发现浙江省中蜂变异丰富，曹联飞等(2017)利用线粒体分子标记研究发现浙江丽水地区中蜂的遗传多样性水平较高。

金华市位于浙江省中部，交通便利，为浙中丘陵盆地地区，属亚热带季风气候，蜜源植物丰富。金华市中蜂养殖历史悠久，各个区县市均有分布。据统计，金华市中蜂养殖数量已由2012年的1万余群增长到目前的7万余群(赵东绪等, 2012)。然而目前还没有关于金华市中蜂遗传多样性的系统研究。为了解金华市中蜂的遗传多样性及遗传分化现状，本研究基于常用的mtDNA tRNAleu～COⅡ序列对金华市中蜂进行遗传多样性分析，旨在为金华市中蜂资源的有效保护和合理开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2016年在金华市下辖所有9个区县市各随机选择3个蜂场，每个蜂场采集3群中华蜜蜂。蜂场的蜂群来源主要为本地野生收捕，长期定地饲养。每群随机取几十头工蜂，放入无水乙醇中，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1基因组DNA提取

取无水乙醇浸泡保存的蜜蜂样本，每群随机取1头工蜂，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP1201(北京百泰克生物技术有限公司)的说明和步骤提取蜜蜂总DNA。

1.2.2序列扩增与测序

使用PCR引物E2: 5′-GGCAGAATAAGTG CATTG-3′和H2: 5′-CAATATCATTGATGACC-3′对mtDNA tRNAleu～COⅡ序列进行扩增(Garneryetal., 1992)。PCR反应体系为40 μL，其中10×buffer 4 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 nmol/L引物各1.6 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL。反应程序为：94°C 5 min；94°C 1 min，50°C 1 min，72°C 1 min，35个循环；72°C 10 min。PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。

1.2.3数据分析

使用DNAStar 5.0(DNASTAR Inc., Madison, WI)和Clustal X 2.0(Larkinetal., 2007)进行序列拼接和比对。利用MEGA 7.0(Kumaretal., 2016)输出碱基组成、变异位点、简约信息位点，进行遗传距离计算，构建NJ系统发育树等。利用DnaSP 6.0(Rozasetal., 2017)进行单倍型分析，计算单倍型多样度、核苷酸多样度和核苷酸差异数。应用Arlequin 3.5(Excoffier and Lischer, 2010)软件进行分子方差分析(AMOVA)检测遗传变异来源，计算群体间遗传分化系数(F-statistics,FST)及其显著性，并采用Tajima’sD和Fu’sFs中性检验估算群体历史动态变化(Tajima, 1989; Fu, 1997)。应用Network 4.0(Bandeltetal., 1999)构建单倍型网络图。

2 结果与分析

2.1 序列碱基组成及变异

对81个样品的序列进行比对，截除两端引物序列后，大部分序列长度为414 bp，另外8条序列由于缺失1个碱基为413 bp。以414 bp序列为标准，1～18 bp为tRNAleu基因部分序列，19～107 bp为非编码区序列，108～414 bp为COⅡ部分序列。1个碱基缺失发生在非编码区。所有序列碱基A、T、G、C的平均含量为39.4%、45.2%、5.5%和9.9%，A+T碱基含量(84.6%)明显高于G+C含量(15.4%)。

序列变异分析结果显示共有14个变异位点，其中9个在非编码区，5个在COⅡ编码区。一个变异位点为A缺失，其余变异位点A/G有6个，T/C有3个，A/T有3个，A/C有1个。变异位点包括6个简约信息位点和7个单一多态位点。

2.2 群体多样性

金华市中蜂共发现14个单倍型，各地理群体的单倍型数量为2～4种(表1)。单倍型JH1为金华市所有9个地理群体的共享单倍型，占金华市中蜂总样本数的61.73%。金东、义乌和浦江的单倍型JH1占各自样本数不到50%，其余区县市单倍型JH1占各自样本数均超过50%。单倍型JH2和JH3分别仅在金东和浦江的样本中发现，且均占自身样本总数超过50%；单倍型JH5和JH9仅在东阳的样本中发现；单倍型JH6仅在永康的样本中发现；单倍型JH7和JH10仅在兰溪的样本中发现；单倍型JH11和JH12仅在磐安的样本中发现；单倍型JH13和JH14仅在义乌的样本中发现。所有单倍型中，单倍型JH9和JH13序列在NCBI数据库中尚未见报道(新申请的NCBI登录号分别为MT263731和MT263732)。

金华市中蜂整体单倍型多样度(Hd)为0.610(表1)。各个地理群体中，义乌的单倍型多样度最高(0.750)，其次是东阳(0.639)，婺城、

表1 金华市中蜂样本采集信息与多样性指数

武义、磐安的单倍型多样度最低(均为0.417)。金华市中蜂整体核苷酸多样度(Pi)为0.00162，各地理群体中东阳最高(0.00282)，婺城和武义最低(均为0.00054)。各个地理群体的平均核苷酸差异数也是东阳最大，婺城和武义最小。

2.3 群体遗传结构

金华市中蜂地理群体间的遗传距离分析显示(表2)，平均遗传距离为0.002±0.001。金东(JD)、浦江(PJ)、东阳(DY)两两群体间的遗传距离最大，均为0.003，而且这3个群体与金华市其它群体间的遗传距离也较大(0.002～0.003)。婺城(WC)与武义(WY)群体间的遗传距离最小(0.000)。

群体分子变异分析(AMOVA)结果显示，金华市中蜂地理群体间有较明显的遗传分化(FST=0.212,P<0.01)，但这种变异大部分来自于群体内部，占78.79%，少部分的遗传变异来自于群体间，占21.21%。

各地理群体间的遗传分化系数FST为-0.125～0.500(表2)。其中金东(JD)与金华市其它地理群体间的遗传分化系数FST最大(0.286～0.500)，存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。其次，浦江(PJ)与金华市其它地理群体间的遗传分化系数FST也较大(0.224～0.500)，存在显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01)。

表2 金华市中蜂地理群体间的遗传距离(对角线上)和遗传分化指数(对角线下)

2.4 群体历史动态

Tajima’sD中性检验和Fu’sFs中性检验可用于推测群体经历的历史。当Tajima’sD和Fu’sFs呈负值，并达到显著水平(P<0.05)时，可能预示着群体经历过群体扩张。而且一般认为，与Tajima’sD相比，Fu’sFs能更好地检测种群扩张现象。本研究结果显示(表1)，婺城、兰溪、义乌、武义、磐安中蜂群体的Tajima’sD和Fu’sFs均为负值，但是只有婺城、武义、磐安的Fu’sFs检验达到了显著差异(P<0.05)。金华市中蜂整体的Tajima’sD和Fu’sFs均为负值，且都达到了极显著差异(P<0.01)。

2.5 系统进化树及单倍型网络图

利用邻接法(NJ)对14个单倍型进行聚类分析，形成了两个较为明显的分支(图1)，单倍型JH3和JH9聚为一支，其它单倍型聚为一支。结合单倍型在样本中的分布，JH3来源于浦江，且占浦江样本的大多数，JH9来源于东阳的一个样本。利用单倍型网络图能够更直观看出各单倍型之间的演化关系以及在不同地理群体中的分布情况。单倍型网络图显示(图2)，其它单倍型都以单倍型JH1为中心辐射分布，单倍型JH1可能是最原始的单倍型。

图1 基于邻接法对金华市中蜂单倍型聚类分析Fig.1 Neibor-Joining(NJ)method for cluster analyses of haplotypes of Apis cerana cerana in Jinhua

图2 金华市中蜂单倍型网络图分析Fig.2 Network of haplotypes of Apis cerana cerana in Jinhua

3 结论与讨论

蜜蜂是社会性昆虫，同一个蜂群里的所有工蜂具有相同的母系，因此利用线粒体DNA进行蜜蜂遗传多样性研究具有很大优势。目前已有大量基于线粒体DNA的中蜂遗传多样性研究，尤其是mtDNA tRNAleu～COⅡ序列最为常用(姜玉锁等, 2007; 周姝婧等, 2016; 李彪等, 2018; 王俊杰等, 2018)。本研究采用mtDNA tRNAleu～COⅡ序列对金华市中蜂进行遗传多样性分析，便于与邻近地区中蜂已有研究数据进行对比分析。

本研究单倍型分析发现，单倍型JH1占金华中蜂样本总数的61.73%。而这一单倍型序列也是福建主体单倍型(59.9%)(周姝婧等, 2016)，与已报道的广州序列(姜玉锁等, 2007)以及浙江省丽水市中蜂的主体单倍型(41.5%)(曹联飞等, 2017)也相同。说明金华市中蜂的主要遗传背景与浙江丽水以及福建、广州中蜂相同。单倍型网络图显示，其它单倍型都以单倍型JH1为中心辐射分布，说明单倍型JH1可能是最原始的单倍型，进而进化形成其它单倍型。这可能与群体历史动态分析显示的金华市中蜂群体经历了快速扩张有关。其它13个单倍型中有11个单倍型为某个地理群体的独享单倍型。单倍型JH9和JH13序列则为新发现的单倍型。说明各地理群体也有自己特有的遗传背景。

线粒体序列遗传多样性丰富程度主要以单倍型多样度(Hd)及核苷酸多样度(Pi)为指标。本研究结果显示，81群金华中蜂共存在14个单倍型，平均单倍型多样度Hd为0.610，平均核苷酸多样度Pi为0.00162。之前邻近地区丽水基于相同基因序列的研究发现94群中蜂存在20个单倍型，平均单倍型多样度Hd为0.772，平均核苷酸多样度Pi为0.00352(曹联飞等, 2017)。金华市中蜂的遗传多样性低于丽水市中蜂。金华交通便利，而丽水多山区地理隔离条件更好，可能是主要影响因素。基于相同基因序列的福建省中蜂遗传多样性研究发现，平均单倍型多样度为0.484，平均核苷酸多样度为0.00193(周姝婧等, 2016)。金华市中蜂的平均核苷酸多样度略小于福建，而平均单倍型多样度金华市中蜂明显较大。可能的解释是金华市中蜂群体经历了快速扩张，扩张过程中积累了大量的新突变，单倍型多样性会非常丰富，但是没有充足的时间积累足够的核苷酸变异(Aviseetal., 1984)。本研究的群体历史动态研究结果也给予了支持。中蜂适应能力较强，当气候环境适宜时群体数量增长较快。金华市地处浙中丘陵盆地，蜜源植物丰富，可能为中蜂群体的快速扩张提供了有利条件。

当研究个体数较少时，核苷酸多样度(Pi)比单倍型多样度(Hd)更有说服力。金华市中蜂各地理群体中，东阳的核苷酸多样度最高(0.00282)。此外，东阳与金华市其它地理群体间的遗传距离也较大，在东阳群体中还发现了新单倍型JH9，聚类分析中单倍型JH9和JH3单独聚为一支,说明东阳中蜂群体具有一定的特殊性。一般认为，FST>0.25时, 群体间有很大的遗传分化。金东群体与金华市其它群体间的遗传分化系数FST较大(0.286～0.500)，浦江群体与金华市其它群体间的遗传分化系数FST也较大(0.224～0.500)。遗传距离分析也显示金东和浦江两个群体与金华市其它群体间的遗传距离较大。因此，在未来金华市中蜂资源的保护与利用中，金东、浦江、东阳群体需要给予重视。