昆虫锌金属蛋白酶研究进展

刘 彬，侯有明，汤宝珍*

(1. 福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室，福州 350002；2. 福建省昆虫生态重点实验室，福州 350002)

酶是由活细胞产生的、具有高度底物特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。根据催化机制可分为6类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和合成酶。水解酶指的是催化水解反应的一类酶，常见的有蛋白酶、淀粉酶、胰蛋白酶和核酸酶等。其中蛋白酶是研究最早也是最深入的一类，其催化原理就是水解蛋白质中的肽键。根据所水解肽键的位置可分为外肽酶和内肽酶两大类。蛋白酶在昆虫的各种生命活动中有着不可或缺的作用，比如在中肠中参与食物的水解，在血淋巴中参与免疫系统的激活反应，在蜕皮液中参与表皮的降解等(Samuels and Paterson, 1995; Bownetal., 2004; Fortieretal., 2007; Kanost and Jiang, 2015)。锌金属蛋白酶是昆虫金属蛋白酶的一种，在昆虫体内发挥着重要作用。本文在概述昆虫锌金属蛋白酶的结构与分类的基础上，重点介绍了其功能特征，以加深人们对昆虫锌金属蛋白酶的认识，以期为深入研究其功能、发现害虫防治新靶标提供参考。

1 锌金属蛋白酶概述

锌金属蛋白酶(Zinc metalloproteases)是一类活性中心保守、依靠锌离子催化肽键水解的蛋白水解酶，广布于动物、植物、真菌、细菌、病毒及寄生虫中(Turneretal., 2001; Carpentieretal., 2004; Overall and Kleifeld, 2006)。在哺乳动物中可参与多种生命活动的调控，如胚胎发育、组织病变、细胞形态重塑及伤口愈合等重要生理过程(Page-McCawetal., 2007)，同时也与常见疾病如癌症、高血压、动脉粥样硬化、白血病等的发生和治疗有密切关系(毛居戴·亚力等, 1999; 陈香红, 2007; 姚益群等, 2019)。近年来在多种昆虫中也发现了许多锌金属蛋白酶，如黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、棉铃虫Helicoverpaarmigera、冈比亚按蚊Anophelesgambiae、赤拟谷盗Triboliumcastaneum和家蚕Bombyxmori等。由于昆虫相对于哺乳动物来说体型小、结构相对简单、操作简便，因此更便于对其金属蛋白酶进行深入研究，且有助于更好地理解锌金属蛋白酶的类型及其各自的功能。

2 锌金属蛋白酶的结构与分类

早期，Jiang等(1992)将含锌离子的蛋白酶划分为5个家族。随后，Hooper(1994)又进行了一次划分，他将龙虾肽酶(Astacin)、沙雷氏菌蛋白酶(Serratia proteases)、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteases, MMPs)以及Reprolysin这4类蛋白酶统一划分到锌蛋白家族的甲硫氨酸锌蛋白亚族中，同时将嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)划分到锌蛋白家族的谷氨酸锌蛋白亚族中。锌金属蛋白酶中有不同的锌离子结合基序，如HEXXH(斜体加粗表示锌离子的配体氨基酸，粗体表示涉及催化的氨基酸，X为任意氨基酸)等。根据不同的基序，可将锌金属蛋白酶超家族分为4个家族(图1)：锌蛋白(Zincins)、羧肽酶(Carboxypeptidases, CPs)、DD-羧肽酶(DD-carboxpeptidases)及反锌蛋白(Inverzincins)。其中锌蛋白的锌离子结合基序为HEXXH，与之相对的为反锌蛋白，其基序为HXXEH，CPs的基序为HXXE，DD-羧肽酶的基序为HXH。

图1 锌金属蛋白酶家族(根据Hopper, 1994修改)Fig.1 Families of zinc metalloproteases

锌离子的配体指的是与锌离子配位的氨基酸，在锌金属蛋白酶中锌离子的配体氨基酸有3个，大多数锌金属蛋白酶都有2个位于锌离子α螺旋处的组氨酸。对于锌蛋白家族来说，所有成员都有2个位于锌离子结合基序HEXXH中的组氨酸配体，根据与锌离子结合的第三个配体氨基酸的不同，该家族可进一步划分成3个亚族：甲硫氨酸锌蛋白(Metzincins)、谷氨酸锌蛋白(Gluzincins)及天冬氨酸锌蛋白(Aspzincins)。甲硫氨酸锌蛋白的第三个配体为组氨酸，在这个亚族里有7种蛋白酶，分别为龙虾肽酶、沙雷氏菌蛋白酶、MMPs、Reprolysin、利什曼溶蛋白(Leishmanolysin)、Snapalysin及最近在细菌Myroidessp.中发现的Myroilysin(Xuetal., 2017)。谷氨酸锌蛋白的第三个配体为谷氨酸，包含6种蛋白酶，分别为嗜热菌蛋白酶、肽链内切酶(Endopeptidases)、血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)、脑啡肽酶(Neprilysin, NEP)、破伤风和肉毒杆菌神经毒素(Tetanus and Botulism neurotoxins)及氨肽酶(Aminopeptidases, APs)。天冬氨酸锌蛋白的第三个配体为天冬氨酸，Aspergillusoryzae的Deuterolysin是第一个被发现的天冬氨酸锌蛋白酶(Fushimietal., 1999)。CPs家族可根据锌离子结合基序进一步划分为3个亚族，第一个亚族包括CPA和CPB，其共有基序为BHSYSQ；第二个亚族中有CPT和StreptomyceCP，共有基序为FHTYSE；第三个亚族包含CPH、CPM和CPN，共有的基序为LHGGXB。

反锌蛋白家族比较小，由胰岛素降解酶(Insulin degrading enzyme, IDE)、Pitrilysin和酵母增强加工蛋白(Processing-enhancing protein)组成，包含反向锌结合基序。

DD-羧肽酶最早在白色链霉菌Streptomycesalbus中被发现，其中两个锌离子配体位于DHXHV基序中，第三个锌离子配体位于基序SRHMY的N末端侧，这与其它锌金属蛋白酶的锌离子配体的位置都不同(Becker and Roth, 1993)。DD-羧肽酶家族的金属蛋白酶主要在细菌如铜绿假单胞菌和大肠杆菌中分布(Presslitz and Ray, 1975; Mallicketal., 2019)，在昆虫中还未发现。

目前MEROPS(http://merops.sanger.ac.uk)数据库里共有103个金属蛋白酶家族，这些家族中的金属蛋白酶有的具有内肽酶活性(如M13家族)，有的具外肽酶活性(如M14家族)，也有的既有内肽酶活性又有外肽酶活性(如M3家族)。在昆虫中发现的锌金属蛋白酶也可以划分到数据库内对应的家族中(图2)：APs(M1家族)、ACE(M2家族)、MMPs(M10家族)、NEP(M13家族)、CPs(M14家族)和IDE(M16家族)。

图2 锌金属蛋白酶结构示意图Fig.2 Schematic diagrams of structure of zinc metalloproteases注：SP，信号肽；M1，金属蛋白酶M1结构域；ERAP1，内质网氨基肽酶1结构域；M2，金属蛋白酶M2结构域；Collectrin，一种单程跨膜蛋白结构域；Pro，前肽区；M10，金属蛋白酶M10结构域；Hem，类血红素结合蛋白区；M13，金属蛋白酶M13结构域；M14，金属蛋白酶M14结构域；M16，金属蛋白酶M16结构域。Note: SP, Signal peptide; M1, Metalloprotease 1 domain; M2, Metalloprotease 2 domain; Collectrin, A single-pass transmembrane protein domain; Pro, Pro-peptide; M10, Metalloprotease 10 domain; Hem, Hemopexin-like domain; M13, Metalloprotease 13 domain; M14, Metalloprotease 14 domain; M16, Metalloprotease 16 domain.

3 锌金属蛋白酶的功能特征

3.1 羧肽酶(CPs)

在哺乳动物中存在3种编码消化羧肽酶的基因，分别称为CPA1、CPA2和CPB(Clauseretal., 1988)。在昆虫中发现的CPs主要分为两类，一类与昆虫消化吸收食物有关(CPA1、CPA2和CPB)，其中CPA和CPB结构相似，都具有一段前肽，CPA主要对芳香族、脂肪类及疏水性残基具有较强的切割能力，而CPB会优先剪切碱性氨基酸残基，其次也会剪切一些非碱性残基(Segundo, 1982)；另一类是CPE和CPD，与CPA和CPB不同之处在于二者不含或仅含一小段前肽(Fricker, 1988; Walteretal., 1996)。

Ward(1976)首次在衣蛾Tineolabisselliella的消化道内发现了CPs，其活性能被马铃薯羧肽酶抑制剂(Potato carboxypeptidase inhibitor)和邻二氮杂菲(Phenanthroline)强烈抑制，同时该酶对中性脂肪族氨基酸残基具有强烈的偏好，并且不会水解C末端脯氨酸、精氨酸和赖氨酸。类似地，从棉铃虫的肠道中分离检测到CPA和CPB的活性，CPA占据主要地位，而CPB量极少；CPA能在较宽的pH范围内发挥作用，其活性主要被邻二氮杂菲和马铃薯羧肽酶抑制剂抑制；棉铃虫幼虫长期摄入大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(Soybean Kunitz trypsin inhibitor)会导致中肠细胞中CPA基因表达量增加(Bownetal., 1997)。Bown等(2004)随后又从棉铃虫中分离得到一种新CP，其不能水解CPA或CPB的底物，但却能裂解底物C末端谷氨酸残基，这是第一个被鉴别和发现的锌金属蛋白酶家族中对谷氨酸具有特异性的CP。在粉纹夜蛾Trichoplusiani幼虫的中肠中，消化性CPs活性也主要由CPA引起，CPA比CPB的活性高8倍，这两种羧肽酶在pH 8.0～8.5之间都具有较高的酶活，对于马铃薯羧肽酶抑制剂和邻二氮杂菲，二者也展示出相同的抑制现象(Wangetal., 2004)。

在一些双翅目昆虫中，如库态按蚊Anophelesculicifacies和冈比亚按蚊在吸食寄主血液后肠道内CPs基因的表达量显著上升(Ramosetal., 1993; Edwardsetal., 2000)，且其表达量在吸血1 d后到达顶峰(Horleretal., 1995)。Shi等(2017)通过定量PCR也发现，中华按蚊Anophelessinensis体内8个CPs基因的表达在吸血之后发生显著变化。由此可见，在一些吸血昆虫中，血液能够诱导CPs活性的改变，这一改变可能与食物消化相关。

CPs除了具有消化功能，还可能参与免疫反应。当疟原虫进入冈比亚按蚊体内后，冈比亚按蚊CPB基因表达量显著上升，但若使用抑制剂降低CPB的活性，按蚊体内的疟原虫发育也会受到影响(Lavazecetal., 2007)。埃及伊蚊Aedesaegypti中肠的CPB1通过与登革热病毒外壳蛋白互作而抑制该病毒的入侵(Thametal., 2014)。家蚕5龄幼虫喂食感染核型多角体病毒后，中肠中的4个CPs基因表达量升高，表现出对病原侵染的免疫应答作用(朱玉苹等, 2016)。

Sidyelyeva和Fricker(2002)真核表达出黑腹果蝇CPD的两个结构域，D1B(Domain 1B)和D2(Domain 2)，体外酶活实验表明D1B在中性pH下活性更高，D2则在pH 5～6时活性更高；D1B和D2都能裂解C末端为精氨酸或赖氨酸的底物，且D1B在裂解C末端为精氨酸的底物时活性更高，分析认为两个结构域之间的底物特异性和pH的差异可能为CPD行使功能所必需。

CPs在昆虫的生长发育中起着重要作用，包括食物的消化吸收、抵御外源物的免疫反应等。但目前对于昆虫CPs的研究仅限于少数几种昆虫中，且对其功能的研究也仅限于消化食物方面，CPs参与先天免疫防御的研究还有待深入分析。

3.2 基质金属蛋白酶(MMPs)

MMPs是一种内肽酶，隶属于甲硫氨酸锌蛋白酶家族。由于其能够裂解胞外基质中的蛋白而被称为基质金属蛋白酶。大部分MMPs的结构相似，包含一个信号肽、一个前肽、一个催化区、一个铰链区和C末端3个血红素区(Hemopexin domain)(Page-McCawetal., 2003; 2007; 2008)。MMPs在组织重塑、细胞增殖和分化、伤口愈合、胚胎发育及变态等方面都具有重要作用，但其活性通常被内部组织金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase)所抑制(Page-McCawetal., 2007; Srivastavaetal., 2007)。

在哺乳动物中MMPs的底物分布很广，包括生长因子、细胞附着因子、趋化因子和细胞活素等(Sternlicht and Werb, 2001; Greenleeetal., 2007)。由于昆虫体型小，遗传背景清晰，且一种昆虫中最多不超过3个MMPs，这使得在昆虫中解析MMPs功能变得简单。

目前，黑腹果蝇中发现的两个MMPs(Dm1-MMP和Dm2-MMP)都对其神经系统的发育、脂肪体解离、稳态调控、肿瘤细胞转移和组织重塑具有重要作用(Srivastavaetal., 2007; Zhengetal., 2016; 2017; DeVaultetal., 2018)。Dm1-MMP和Dm2-MMP能以一种合作的方式引导果蝇脂肪体解离，Dm1-MMP能够破坏DE-钙粘素(DE-cadherin-mediated)介导的细胞与细胞之间的连接，而Dm2-MMP负责裂解基底膜，二者共同作用破坏了细胞与基底膜之间的连接最终导致脂肪体的解离(Jiaetal., 2014)。同样地，Wen等(2020)对表达纯化的Dm1-MMP和Dm2-MMP的催化域(Catalytic domain)进行底物降解实验，也发现Dm1-MMP和Dm2-MMP在组织重塑中具有协同作用但具有不同功能。MMPs的血红素(Hemopexin domain)区域对于要入侵的组织还具有特异性(Glasheenetal., 2009)。此外，Dm2-MMP能促进排卵进程和黄体的生成(Deadyetal., 2015)。

在大蜡螟Galleriamellonella中发现的Gm1-MMP能够增强Ⅳ型胶原蛋白的降解，在组织重塑和应对细菌脂多糖的感染中发挥了重要作用(Altincicek and Vilcinskas, 2008)。赤拟谷盗的2个 MMPs(Tc1-MMP和Tc2-MMP)，在结构和功能上都与Dm1-MMP类似，干扰Tc1-MMP后其身体多处部位不能正常发育，同时抵御白僵菌侵染的能力也下降，干扰Tc2-MMP后幼虫肠道发育受损，这些表明MMPs对赤拟谷盗的生长发育以及免疫系统的运作具有重要影响(Knorretal., 2009)。烟草天蛾Manducasexta的Ms1-MMP在其蜕皮时表达量提高了10倍，且在注射MMPs抑制剂后，幼虫生长发育速度变缓，这表明Ms1-MMP参与了蜕皮过程，对维持正常发育起着重要作用(Vishnuvardhanetal., 2013)。家蚕的3个MMPs(Bm1-MMP、Bm2-MMP和Bm3-MMP)扮演着不同角色，Bm1-MMP和Bm2-MMP参与翅芽的发育，Bm3-MMP与体重有关；在家蚕被病原物感染后，MMPs表达量上升，过表达MMPs会增加病毒的繁殖量，而敲除MMPs后可抑制病毒繁殖量，这表明少量的MMPs能促进免疫系统运作，而过量的MMPs会对机体产生不利影响(刘太行, 2017; Kawasakietal., 2018)。

尽管在哺乳动物中已有相当多关于MMPs的研究，但目前在昆虫中MMPs研究才刚刚开始，虽然MMPs在昆虫生长发育、组织重塑及先天免疫方面具有重要作用，但它们在昆虫中的作用底物以及在免疫系统中的作用机制尚不清楚。还有很多问题亟待解决，如MMPs是如何参与免疫系统运作，MMPs为何过表达后会对机体产生毒害作用等。

3.3 脑啡肽酶(NEP)

NEP是位于神经细胞上的胞外酶，能灭活脑啡肽(Enkephalins)，故将其命名为脑啡肽酶，在细胞表面肽信号关闭中起着重要作用。作为一种胞外酶，NEP在细胞外催化肽的水解，通过对位于N端P1′疏水性氨基酸残基的切割,优先水解相对短的寡肽(不超过30个氨基酸)。同时，NEP能够被塞奥芬(Thiorphan)和膦酰二肽(Phosphoramidon)这两种抑制剂强烈抑制(Roquesetal., 1993)。NEP能够通过裂解脑啡肽和速激肽家族的P物质(Substance P)从而关闭脑中的神经信号(Malfroyetal., 1978; Barnesetal., 1993)。除了在神经系统中的作用外，NEP还参与了哺乳动物神经、心血管、炎症和免疫系统的调节肽的代谢(Turneretal., 2001)。如通过抑制心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide)来终止钠离子排泄和血管舒张活动(Turneretal., 2001)。NEP在癌症发生方面也扮演着重要的角色，由于香烟的刺激导致肺部NEP下调可能与一些小细胞癌变有关(Shippetal., 1991)。

昆虫中也存在类似哺乳动物NEP活性的酶，这些酶能够降解那些控制行为和生理的神经肽。在沙漠蝗Schistocercagregaria大脑的突触膜上，富含一种可能负责代谢的类NEP内肽酶，介导肽递质和调节剂的失活(Isaac, 1988)。在东亚飞蝗Locustamigratoria大脑的蘑菇体、中央体神经纤维和视叶中都检测到了对膦酰二肽敏感的内肽酶活性，这些内肽酶可能是速激肽信号系统中的一部分，负责对突触的速激肽灭活。在东亚飞蝗和蟑螂中，大脑中NEP裂解速激肽这一功能是保守的(Isaac and Nässel, 2003)。黑腹果蝇中至少存在20多个NEP基因，果蝇NEP2的体外实验证实其能够裂解蝗虫速激肽和果蝇速激肽(Thomasetal., 2005)。根据NEP2在马氏管和两性生殖器官中高丰度的表达，推测其可能在肾脏和生殖中具有重要作用(Thomasetal., 2005; Chintapallietal., 2007)。果蝇中的NEP4有两种形式，一种为膜结合形式，另一种为可溶形式(Meyeretal., 2009)。在果蝇的每个发育阶段至少都存在一种NEP4的异构体，表明果蝇整个生命周期都需要NEP4参与。在黑腹果蝇胚胎发育过程中，NEP4在围心细胞、Muscle founder cells、神经胶质细胞(Glia cells)及雄性生殖腺中皆有表达(Meyeretal., 2009)。体外异源表达的NEP4对P物质和血管紧缩素(Angiotensin I)表现出底物偏好性，显示出与人NEP2相似的底物特异性(Meyeretal., 2009)。Sitnik等(2014)进一步研究了NEP在生殖方面的作用：在雌性个体中，NEP1、NEP2和NEP4表达量的降低会导致产卵量减少；NEP2的增加还能导致黑腹果蝇表现出异常的攀爬行为，野生型呈直线垂直上升，NEP2过度表达个体则呈螺旋上升，并在静止期表现出梳理行为的增加，据此推测NEP过度表达造成了神经肽信号的干扰从而导致了运动行为异常(Blandetal., 2009)。此外，果蝇的NEP4通过裂解相关调节肽从而调控胰岛素通路和食物的摄取(Hallieretal., 2016)。

在一些寄生蜂如匙胸瘿蜂Leptopilinaboulardi、镶颚姬蜂Hyposoterdidymator、阿尔蚜茧蜂Aphidiuservi的毒液中发现NEP(Dorémusetal., 2013; Colinetetal., 2013; 2014)，同时在仓蛾姬蜂Venturiacanescens的卵巢萼区中也发现了NEP(Asgarietal., 2002)。目前对于NEP在寄生蜂中或寄生蜂与寄主互作中的作用还不清楚，仅Asgari等(2002)推测NEP可能通过破坏寄主免疫相关肽调控寄主的免疫反应。

NEP在哺乳动物的研究比较多，与多种疾病如高血压、癌症的发生及阿尔茨海默症的致病机制密切相关，但NEP在昆虫中的生理功能和作用底物尚不清楚，目前仅鉴定出黑腹果蝇NEP4的底物肽能够影响胰岛素样肽的表达，从而调控胰岛素信号通路和食物的摄取。NEP在昆虫体内的功能可能多样化，包括调控生长发育、生殖及免疫防御等，但这些都有待进一步研究。

3.4 胰岛素降解酶(IDE)

对昆虫IDE的研究主要集中在黑腹果蝇，黑腹果蝇IDE的氨基酸序列与人的IDE有30%的相似性(Shenetal., 2006)。IDE能够裂解哺乳动物的胰岛素，其水解胰岛素B链肽键位点包括B10-B11、B14-B15、B16-B17和B25-B26，这些切割位点与哺乳动物胰岛素蛋白酶中的4个切割位点相对应，这表明IDE在进化中是相对保守的(Garciaetal., 1988; Duckworthetal., 1989; Kuoetal., 1991)。黑腹果蝇中IDE的过表达与胰岛素缺乏呈现出的表型相同，这表明黑腹果蝇体内IDE同样具有裂解胰岛素的功能(Tsudaetal., 2010)。Galagovsky等(2014)发现黑腹果蝇的IDE能够通过调节磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(PI3K)途径从而限制生长发育，认为IDE是胰岛素信号的调节剂，其功能的丧失有利于胰岛素抵抗。

胰岛素抵抗是II型糖尿病(Diabetes mellitus type II, DMII)的标志，实际上在人和小鼠的研究中很早就发现了IDE降解与DMII之间的联系(Rudovichetal., 2009; Abdul-Hayetal., 2011)，但能将IDE和DMII的起源关联的机制还不清楚。

目前对于昆虫IDE的研究还很少，虽然发现黑腹果蝇IDE能够裂解胰岛素，但具体的分子机理还不清楚，对其机理的揭示还可为DMII的研究提供参考依据。

3.5 血管紧张素转化酶(ACE)

ACE也称为二肽基羧肽酶。昆虫的ACE首次从家蝇Muscadomestica的头膜中分离得到(Lamango and Isaac, 1993)，且其氨基酸序列与哺乳动物的ACE高度保守(Quanetal., 2001)，区别在于哺乳动物ACE在C末端存在一个膜锚定位点(Membrane anchor)，而昆虫ACE没有，这使得大部分哺乳动物的ACE为膜结合形式，而昆虫的为可溶形式(Korneeletal., 2002)。

血管紧张素I(Angiotensin I, AI)、缓激肽(Bradykinin)和P物质通常被认为是哺乳动物ACE的生理底物，虽然在昆虫体内中还未发现与AI、血管升压素II(Vasoconstrictor angiotensin II)、缓激肽有关的肽或激素(Isaacetal., 1999)，但体外实验发现纯化后的家蝇和黑腹果蝇的ACE能裂解哺乳动物的许多神经肽或激素，如白细胞激肽(Leucokinin)、蝗虫速激肽(Locustatachykinin)、脑啡肽和抑咽侧体神经肽(Allatostatin)(Lamangoetal., 1997; Siviteretal., 2002)。虽然昆虫ACE能裂解很多神经肽，但在不同昆虫中裂解速度不同，如黑腹果蝇的ACE能快速裂解蝗虫速激肽，但裂解其他昆虫速激肽的速度较慢甚至无法水解(Siviteretal., 2002)。此外，在一些昆虫如甘蓝夜蛾Mamestrabrassica、家蚕、马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata、竹节虫Carausiusmorosus、灰肉蝇Neobellieriabullata和马德拉蜚蠊Leucophaeamaderae的脑部神经纤维网中能检测到ACE荧光，这暗示ACE可能参与昆虫神经系统中神经肽的胞外代谢(Schoofsetal., 1998)。

ACE在生殖方面也具有作用。对班须按蚊Anophelesstephensi雌虫使用ACE抑制剂后，其产卵量显著低于正常雌蚊(Ekboteetal., 2003)。有趣的是在斜纹夜蛾Spodopteralittoralisy幼虫期饲喂ACE抑制剂卡托普利(Captopri)对雌成虫的产卵量无影响，而对雌成虫进行卡托普利处理则使其产卵量减少30%(Vercruysseetal., 2004)。在番茄夜蛾Lacanobiaoleracea中也发现使用卡托普利后雌虫产卵量下降(Ekboteetal., 2003)。

ACE在昆虫的生长发育中也扮演着重要的角色。如ACE抑制剂福辛普利(Fosinoprilat)能延缓烟草天蛾4龄幼虫的生长速率(Isaacetal., 2007)。卡托普利能使海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis的化蛹率下降80%(Vercruysseetal., 2004)。黑腹果蝇中存在两种与哺乳动物结构类似的ACE，分别命名为ANCE和ACER(Tayloretal., 1996)。ANCE突变的黑腹果蝇的胚胎发育正常，无明显缺陷，但无法成功孵化，推测ANCE可能参与孵化相关肽的加工途径(Isaacetal., 2007)。ACER在果蝇胚胎中表达，而且主要在假定的背侧脉管区域的细胞中表达(Tayloretal., 1996)，据此推测其可能与心脏的功能相关。Crackower等(2002)发现在ACER中插入P原件(Lethal transposon insertion strain)会使黑腹果蝇幼虫心脏中原组细胞分布无序且数量减少，最终导致1龄或2龄幼虫死亡，由此得出ACER影响心脏功能的结论。但Isaac等(2009)通过实验发现，当P原件被P原件转座酶精确切除时，这种幼虫死亡的现象并没有消失，可能的解释是前者插入P原件时在同一染色体上可能产生了新的致死突变，所以ACER与心脏间的关系还需进一步研究。

此外，ACE可能还参与昆虫的消化和免疫反应。如ACE通过影响蚜虫取食行为进而调控蚜虫与植物的互作(Wangetal., 2015)。注射脂多糖能导致东亚飞蝗血淋巴中的ACE基因转录水平提高10倍(Macoursetal., 2003; Duressa and Huybrechts, 2016)，在冈比亚按蚊中也存在类似的现象(Aguilaretal., 2005)。褐飞虱Laodelphaxstriatellus感染水稻条纹病毒后，其脂肪体和睾丸中ACE基因表达量显著上升(Wangetal., 2019)。

ACE在昆虫中的生物学功能是多样的，如参与了幼虫的生长和发育、神经肽的代谢失活和生物合成、食物的消化、雌虫的繁殖及先天免疫等方面。虽然通过体外实验证明ACE能够裂解很多神经肽，但其在昆虫体内的代谢方式还不清楚。在黑腹果蝇中发现ACER与心脏之间有联系，但二者作用的机制也未被阐明。此外，ACE参与免疫反应具体的免疫信号通路也未被发现。

3.6 氨肽酶(APs)

APs是一种重要的外肽酶，能够水解N末端氨基酸，在动植物中广泛存在(Taylor, 1993)。在昆虫中的功能也是多样的，包括消化食物(Noriegaetal., 2002)、参与神经肽的灭活(Isaac, 1987)及细胞周期的调控等(Brownless and Williams, 1993; Taylor, 1993)。

根据氨肽酶在细胞中的定位、对pH值及对不同氨基酸水解的偏好，其可分为4类：氨肽酶A(APA)、氨肽酶P(APP)、氨肽酶N(APN)和氨肽酶W(APW)(Tieku and Hooper, 1992)。APA能够优先水解N端有酸性氨基酸的底物肽(Brownless and Williams, 1993)，APP能够水解P1′位置是脯氨酸的肽(Simmons and Orawski, 1992)，APN的水解范围甚广(Mcdonald and Barrett, 1986)，但偏好水解中性多肽或蛋白(Matsasetal., 1985)，APW优先水解一些较短的肽(Gee and Kenny, 1987)。

昆虫中的APA同哺乳动物一样，也有两种形式，膜结合形式和可溶形式(Ferreira and Terra, 1984; 1985; Lenzetal., 1991)。哺乳动物中的APA能将血管紧张素II转化为血管紧张素III(Nagatsuetal., 1970; Brownless and William, 1993)，但昆虫中并不存在血管紧张素，因而APA在昆虫中的作用有待研究。

昆虫中APN的研究相对较多，通过糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyli-nositol)锚定于昆虫中肠细胞膜上(Leeetal., 1996)。APN是苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisCry毒蛋白的重要受体。如Sivakumar等(2007)证实了棉铃虫APN1是Cry1Ac的受体。Cry毒蛋白被昆虫摄取后经蛋白酶分解成小片段与昆虫中肠刷状缘膜囊(Brush border membrane vesicle, Bbmv)上的APN结合引起毒素构象改变，致使细胞膜破损裂解，最终昆虫中毒死亡(Schnepfetal., 1998)。而磷酸酰肌醇特异性的磷脂酶C可将锚定在Bbmv上的蛋白释放，从而减轻Cry对虫体的毒害(Lorenceetal., 1997)。Gill和Ellar(2002)将烟草天蛾的APN1转到对Cry1Ac不敏感的黑腹果蝇中，发现转基因黑腹果蝇取食含Cry1Ac的食物后死亡。沉默斜纹夜蛾的APN4后，再用Cry1Ca处理，发现其死亡率下降75%(Rajagopaletal., 2002)。Cry与APN的结合具有特异性，在某些昆虫中Cry只与特定分子量的APN结合。如烟草天蛾里Cry1C只能与106 kDa的APN结合(Luoetal., 1996)；家蚕中Cry1Aa只和115 kDa的APN结合(Jenkins and Dean, 2001)。有些昆虫只有一种APN可和Cry结合，如在舞毒蛾Lymantriadispar中只有APN1能与Cry1Ac结合，其它形式的Cry如Cry1Aa和CryAb不能与其任何APN结合(Leeetal., 1996)。还有些昆虫中APN可和多种Cry结合，如烟芽夜蛾Heliothisvirescens170 kDa的APN能与3种形式的Cry(1Aa、1Ab和1Ac)结合(Gilletal., 1995; Luoetal., 1997; Olteanetal., 1999; Banksetal., 2001)。

哺乳动物APP能够裂解缓激肽和脑啡肽(Isaacetal., 2009)，且APP能优先裂解倒数第二个位置为脯氨酸的肽，由于脯氨酸存在于一些昆虫神经肽的N末端倒数第二个位置，因此昆虫APP很可能在神经传导中发挥着重要作用，但至今未被证实(Isaacetal., 2009)。迄今为止，没有发现APW参与任何活性肽的代谢(Tieku and Hooper, 1992)。

APN是昆虫中研究最多的，其与Cry的互作对害虫的防控具有重要的参考价值，虽然已经证明APN能与Cry互作，但二者结合后如何造成虫体死亡目前还没有定论。昆虫中并未发现APA的常用底物血管紧张素II，因而具体功能还有待研究，APP也仅是推测其参与神经传导，APW更是未曾发现其参与代谢。

4 总结与展望

目前在昆虫中发现的锌金属蛋白酶的功能多种多样，如CPs参与食物消化和营养物质的吸收，MMPs主要通过降解胞外基质中的蛋白调控昆虫生长发育进程，NEP通过降解相关神经肽调控昆虫的行为与生理活动，IDE通过调控胰岛素的降解从而影响昆虫生长发育进程，ACE参与神经系统的调控，APs参与食物消化、细胞周期调控等。

尽管如此，至今仍有许多问题尚不明晰。如CPs可能还参与一些神经肽的加工甚至某些昆虫的形态发生，但参与的机制未知；其它形式的CPs是否也具有消化食物的作用或其它功能等。MMPs虽能够通过降解胞外蛋白参与调控昆虫生长发育，但其降解的底物蛋白及互作机制尚不清楚；相关证据表明MMPs能够参与免疫调控反应，但如何参与以及过表达MMPs会抑制免疫系统的原因等还需深入分析。昆虫中NEP的功能研究还不多，可能和哺乳动物类似，但NEP的作用底物还未被发现，同时NEP在昆虫免疫系统中的作用也未被阐明；此外，昆虫NEP与淀粉样肽之间的联系及其作用机制仍未阐明，该作用机制可为阿尔茨海默症的治疗提供指导意义。果蝇的IDE能够降解胰岛素，其过表达与胰岛素抵抗的表型相同，该过程与DMII的发生密切相关，但目前有关IDE与DMII的作用机制仍不明确，阐明二者的联系对于临床治疗DMII具有参考价值。ACE分布于昆虫神经纤维网中，其发生机制还需要深入解析，ACE参与昆虫的免疫应答同样需要深入分析。APs功能具有多样性，但目前对于APs的研究主要集中在APN上，有关APA、APP和APW在昆虫中的作用研究比较局限。

哺乳动物中的锌金属蛋白酶研究比较多，昆虫中发现的许多锌金属蛋白酶与哺乳动物具有相似的序列特征和作用底物，因而可借鉴哺乳动物的相关研究来推测其在昆虫体内多样化的功能，最终为害虫防治提供新思路和新途径。