水城小黄姜总黄酮提取工艺优化及抗氧化作用研究

翁贵英李金辉朱淼谢斐

（1六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州 六盘水553001；2六盘水师范学院化学与材料工程学院，贵州 六盘水553001）

生姜为姜科（Zingiberaceae）姜属(Zingiber)植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根茎，具有抗过敏、抗肿瘤、降胆固醇、抗氧化、促进血液循环、调节中枢神经以及解毒等多种生理作用[1]，是药食同源的保健植物品种。生姜中含有多酚、黄酮[2]、嘌呤、姜油[3]等多种生物活性成分，是其发挥重要生理功能的物质基础。

黄酮类化合物是植物体内大量存在的一类物质，在延缓衰老、消炎镇痛、预防癌症等多个方面具有明显功效[4]，同时还具有显著的抗氧化活性。现代医学表明，肿瘤、炎症及退行性疾病等均与自由基的清除存在一定联系，因此，抗氧化活性是预防和抵抗多种疾病的重要方法[5]。

水城小黄姜历史悠久，据《水城厅志·食货》记载早在乾隆年间水城即盛产小黄姜。其产地主要分布于水城区的发耳镇、新街乡、都格镇、鸡场乡、杨梅乡、营盘镇以及龙场乡等。其中以发耳小黄姜品质为上佳，富含硒[6]及多种微量元素[7]，为全国名特优新农产品[8]和国家地理标志保护产品[9]。目前，关于水城小黄姜的研究主要集中在农产品开发、高产栽培技术[10]及微量元素的测定[7]等方面，对其黄酮及自由基的清除作用鲜见报道。本研究利用L9（34）正交设计对小黄姜黄酮化合物的提取工艺进行优选，并进一步检测总黄酮提取液对亚硝基、DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除活性，旨在为水城小黄姜的开发和合理利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

水城小黄姜采自贵州省水城区发耳镇，采回后洗净、去皮、切片，自然风干，粉碎备用。

芦丁、硫酸亚铁、水杨酸、硝酸铝、过氧化氢、无水乙醇、二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、柠檬酸、磷酸二氢钠、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、95%乙醇、ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]、氢氧化钠、过硫酸钾等均为国产分析纯。

高速万能粉碎机(浙江温岭市林大机械有限公司)、台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)、电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、Scientz-IID型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、722可见分光光度计(北京东西仪器有限公司）、DZKW-D水浴锅（上海菁华科技仪器有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

将干燥的芦丁10 mg溶于70%乙醇溶液，配置浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液。分别取标准品0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL置于10mL容量瓶，依次加入5.5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0 mL的70%乙醇补齐至5.5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，6 min后再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，6 min后再加4%的氢氧化钠溶液4 mL，加70%的乙醇定容，15 min后在波长510 nm处测其吸光度A，绘制芦丁标准曲线。

1.2.2 单因素试验

在乙醇浓度90%、料液比1∶20 g/mL时，分别检测超声时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min条件下的黄酮得率；在乙醇浓度90%、超声时间40 min时，分别检测料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL条件下的黄酮得率；在料液比1∶20 g/mL、超声时间40 min时，分别检测乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、100%条件下的黄酮得率。

1.2.3 水城小黄姜总黄酮提取工艺正交试验

基于单因素试验结果，对乙醇浓度、提取时间、料液比三个条件进行L9(34）正交设计，每组重复三次。详见表1。

表1 总黄酮提取的正交试验因素与水平Table 1 Variables and levels in the orthogonal experiment design of Extraction Process of Total Flavonoids

1.2.4 水城小黄姜总黄酮抗氧化活性检测

根据正交实验结果得到水城小黄姜总黄酮提取最优工艺，并将最优条件下的提取液梯度稀释10、40、80、160和320倍后进行抗氧化活性检测，参照文献实验方法进行亚硝基的清除试验[11]、DPPH自由基的清除试验[12]、羟自由基的清除试验[13]、ABTS自由基的清除试验[12]、羟自由基的清除试验[13]、ABTS自由基的清除试验[14]。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度（c，mg/ml）为横坐标，以吸光度（A）作为纵坐标，作芦丁标准曲线，详见图1，其线性回归方程为：Y=1.118 3X+0.007 6（R2=0.999 7）。

图1 芦丁标准曲线Figure 1 The standard curve of rutin

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对水城小黄姜黄酮得率影响

提取时间对水城小黄姜黄酮得率的影响详见图2，总黄酮的得率在0.901%～0.941%之间，随着提取时间的增加其总黄酮得率也增加，在提取时间为40 min时，水城小黄姜总黄酮得率达到最高为0.941%，当继续加大提取时间时，总黄酮得率却降低，最低的得率为0.901%，可能是由于随着超声时间的延长，部分黄酮类物质有被进一步破坏，从而导致得率有所下降[15]，故后续试验选择在超声时间40 min附近进行。2.2.2 不同料液比水城小黄姜总黄酮得率影响不同料液比对水城小黄姜总黄酮得率影响详见图3，其总黄酮的得率0.603%～1.191%之间。当料液比为1∶20 g/mL时水城小黄姜总黄酮得率最高为1.191%，随料液比增加得率略有降低，综合考虑成本及提取效果，后续试验选择在1∶20 g/mL附近进行。

图2 超声时间对黄酮得率的影响Figure 2 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

图3 料液比对黄酮得率的影响Figure 3 Effect of solid-liquid ration on the yield of flavonoids

2.3 正交因素试验结果

根据单因素试验结果，对料液比、乙醇浓度及提取时间进行正交试验，采用SPSS Statistics软件和Microsoft Excel 2007进行试验设计及数据处理，详见表2。

表2 正交试验各条件处理的得率Table 2 Experimental condition and corresponding results

2.2.3 不同乙醇浓度对水城小黄姜得率影响

不同乙醇浓度对水城小黄姜得率影响详见图4，总黄酮的得率在0.730%～0.890%之间。当乙醇浓度为90%时，水城小黄姜总黄酮得率最高为0.890%，乙醇浓度低于或高于90%，水城小黄姜总黄酮得率均低于0.890%，分析可能是此时浓度对水城小黄姜总黄酮溶解度最大，故正交试验选择在90%乙醇浓度附近进行。

图4 乙醇浓度对黄酮得率的影响Figure 4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

9均值1均值2均值3极差3(1∶30)0.96 0.83 0.85 0.13 3(100)0.90 0.92 0.82 0.11 2(40)0.85 0.90 0.88 0.05 1 0.92 0.86 0.86 0.06 8.45

极差越大对黄酮提取的影响就越大，同一个影响因素中均值大小决定因素的不同水平，均值最大值为该影响因素的最佳水平。由表2可知，料液比是影响提取效果的最重要因素，就总黄酮提取率而言，料液比的均值最大为0.96，乙醇浓度的均值最大0.92，提取时间均值最大0.90，A因素的1水平，B因素的2水平，C因素的2水平为最优工艺条件。三个因素对黄酮得率的影响依次为：料液比＞乙醇浓度＞提取时间。其中水城小黄姜总黄酮提取的最佳条件是料液比1∶15，乙醇浓度90%，超声时间40 min。在该工艺条件下，进行三次平行试验，得到水城小黄姜总黄酮的平均含量为1.009%，与表中的结果1.007%相近，进一步证明该工艺的稳定性。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 水城小黄姜总黄酮对亚硝基的清除率

水城小黄姜总黄酮对亚硝基的清除率见图5A，水城小黄姜总黄酮对对亚硝基的清除率在55.68%～10.80%之间，样液稀释到10倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.067 mg/mL，清除率最高可达55.68%。样液稀释到320倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.002 mg/mL，此时清除率最低为10.80%。在该试验设定的浓度范围内，不同浓度水城小黄姜总黄酮提取液对亚硝基均有清除作用，且对亚硝基的清除率随着样液黄酮浓度的增大而增大。

2.4.2 水城小黄姜总黄酮对DPPH自由基的清除率

水城小黄姜总黄酮对DPPH自由基的清除率见图5B,水城小黄姜总黄酮对DPPH自由基的清除率在80.07%～97.81%之间，样液稀释到10倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.067 mg/mL，此时清除率为97.81%，当样液稀释倍数为320倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.002 mg/mL，对DPPH自由基的清除率为80.07%。不同浓度水城小黄姜总黄酮提取液对DPPH自由基都有清除作用，且随着水城小黄姜提取液黄酮浓度的增大清除率增大。在设定的浓度范围内水城小黄姜总黄酮对DPPH自由基清除率均大于80%，表明对DPPH自由基清除率较强。

2.4.3 水城小黄姜总黄酮对羟自由基的清除率

水城小黄姜总黄酮对羟自由基的清除率见图5C,水城小黄姜总黄酮对亚硝基的清除率在29.13%～60.03%之间。样液稀释到10倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.067 mg/mL，清除率最高可达60.03%,当样液稀释倍数为320倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.002 mg/mL，清除率仅为10.80%。在该试验设定的浓度范围内，不同浓度水城小黄姜总黄酮提取液对羟自由基都有清除作用，且随着水城小黄姜提取液黄酮浓度的增大清除率增大。

2.4.4 水城小黄姜总黄酮对ABTS自由基清除率

水城小黄姜总黄酮对ABTS自由基清除率见图5D，水城小黄姜总黄酮对对亚硝基的清除率在5.21%～98.01%之间，样液稀释到10倍时，水城小黄姜总黄酮含量为0.067 mg/ml，清除率最高可达98.01%。样液稀释倍数为320倍，水城小黄姜总黄酮含量为0.002 mg/ml，清除率最低为10.80%。在该试验设定的浓度范围内，不同浓度水城小黄姜总黄酮提取液对ABTS自由基均有清除作用，且随着水城小黄姜总黄酮提取液浓度的增大对其清除率增大。

图5 抗氧化性试验其中：A为亚硝基的清除率；B为DPPH自由基的清除率；C为羟自由基的清除率；D为ABTS自由基清除率Figure 5 Anti-oxidative activity testNote:A Scavenging rate of nitroso-group;B Scavenging rate of DPPH;C Scavenging rate of hydroxy radical;D Scavenging rate of ABTS

对水城小黄姜总黄酮提取液进行亚硝基、DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基抗氧化作用实验，表明其抗氧化作用，随着水城小黄姜样液黄酮浓度的增加而增强，整体变化趋势一致，该试验设定的浓度范围内水城小黄姜总黄酮对DPPH自由基清除率均大于80%，对DPPH自由基清除率较强，此外，水城小黄姜总黄酮对亚硝基、DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率均出现高于50%的清除率，表明整体抗氧化活性良好。

3 结论与展望

目前，对于小黄姜化学成分提取方法的研究主要集中于多糖[16]、姜精油[17]、姜辣素[18]及姜酚[19]等成分提取工艺的优化，对其黄酮及抗氧化活性方面研究较为薄弱。本研究以水城小黄姜为研究对象，采用超声辅助提取总黄酮的方法，利用L9（34）正交设计对工艺进行优选，并检测其总黄酮提取液对亚硝基、DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除活性。结果表明，当乙醇浓度90%，料液比1∶15，超声提取40 min时，其总黄酮的得率达到最大值为1.007%，其提取液对亚硝基、DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率均表现出高于50%的清除率，说明黄酮提取物的抗氧化活性较强。

随着贵州省农业结构调整和“十二大产业”向纵深发展，生姜成为助推脱贫攻坚和乡村振兴的优势品种。水城小黄姜属贵州三大姜之一，是六盘水市特色经济作物。其可食用也可药用，尤其以发耳小黄姜品质上佳，其因含有的姜挥发油和姜辣素含量较高（是其他产姜地区的3至5倍）、辣味浓等优质特点而成为出口免检农产品。2017年，贵州省水城县小黄姜种植面积已达4万余亩，目前该地主要产品为姜茶，其利用率相对较低，如能充分发挥生姜的多项功效，开发具有自主知识产权且附加值高的姜类产品，将带来更大的社会和经济效益，增加种植户的经济收入，推动水城的经济发展。本研究即对水城小黄姜黄酮的提取工艺进行优化，并检测其抗氧化活性，以期为小黄姜的开发利用提供参考。