LncRNA MIR100HG在膀胱癌中的表达及功能的初步研究

2021-08-12应文伟王建峰丁振山何宇辉王爱军周晓峰

中日友好医院学报 2021年3期

应文伟，王建峰，丁振山，陈星，何宇辉，王爱军，周晓峰★

（1.北京大学中日友好临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院泌尿外科，北京 100029；3.北京大学第一医院泌尿外科，北京 100034）

在世界范围内，膀胱癌（BCa）在癌症中死亡率排名第九[1]。尽管手术等治疗的方法已有很大改善，但膀胱癌的复发率仍然很高，预后很差[2]。导致膀胱癌发展的生物学机制尚不清楚，越来越多的证据表明，某些lncRNA 在膀胱癌的进展中起着至关重要的作用。例如，MALAT1 通过特异性抑制miR-125b 并激活靶基因Bcl-2 和MMP-13 来促进膀胱癌[3]。Wang 等研究发现BCAR4 在膀胱癌中高表达，进一步研究表明BCAR4 促进膀胱癌的发展[4]。Xiong 等报道，NRON 表达的增加可促进膀胱癌的增殖、转移和EMT 过程[5]。

近年来，越来越多的研究人员探究了MIR100HG 与肺癌[6]、乳腺癌[7]、大肠癌[8]和其他肿瘤之间的关系。但MIR100HG 与膀胱癌发展之间的关系尚未确定。在本研究拟探讨MIR100HG在膀胱癌中的表达模式，并在体外细胞及裸鼠体内验证MIR100HG 对膀胱癌发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 组织样本

样本来自2016年2月～6月中日友好医院确诊的5 例膀胱癌患者。同时取10 例的20 个样本用做验证。研究得到中日友好医院伦理委员会批准。所有患者均签署了知情同意书，并且了解研究的所有细节。将所有收集的组织样品在RNAlater中冷冻并储存在-80℃。至少2 名病理学家参与了病理诊断。

1.2 RNA 提取和qRT-PCR

TRIzol 试剂盒（购自Invitrogen）用于从组织样品和膀胱癌细胞中提取总RNA。根据制造商的指南，PrimeScript RT 预混液（购自TaKaRa）用于反转录。然后，使用一步TB Green PrimeScript RT-PCR 试剂盒（购自TaKaRa）在ABI 7500 实时PCR 系统（Thermo 公司）上进行了定量实时PCR（qRT-PCR）。引物序列设计如下：MIR100HG 正向，5'-TGCCAGCAGCCATGAGAA-3'，反向，5'-TTGTGAGGTGGAGGAAGGAG-3'；GAPDH 正向，5'-GTCTTCACCACCATGGAGAA-3'，反向，5'-TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3'。GAPDH 被用作内参。MIR100HG 和GAPDH 在不同的孔中扩增并一式三份。

1.3 蛋白质免疫印迹

RIPA 裂解缓冲液用于从细胞中提取总蛋白。将提取的蛋白质与上样缓冲液混合，通过SDSPAGE 分离，转移到PVDF 膜上，然后用5%脱脂牛奶溶液封闭1h。将膜与一抗：α- tubulin（购自Proteintech，11224 -1 -AP，1 ∶5000）、HNRNPA2B1抗体（购自Abcam，31645，1∶2000），4℃过夜，在室温下用辣根与过氧化物酶偶联的二抗孵育1h。使用ECL 化学发光系统检测信号。

1.4 细胞培养与传代

人膀胱癌细胞系EJ 和5637 购自中国科学院细胞系（中国上海）。在补充有10%胎牛血清和100U/ml 青霉素和链霉素的RPMI-1640（均购自Gibco）完全培养基中培养5637 和EJ 细胞。将细胞在37℃下在具有5%CO2的潮湿培养箱中培养。

1.5 细胞计数实验

通过细胞计数试剂盒8（CCK-8）测定法（购自Dojindo Molecular Technologies）分析细胞的增殖能力。将稳定转染的膀胱癌细胞系接种到96 孔板中。进一步孵育1d、3d 和5d 后，将10μl CCK-8溶液添加到相应的孔中2h。最后，通过酶标仪在450nm 波长下测量每个孔的光密度（OD）值。该测定在3 个独立的实验中一式两份进行。

1.6 侵袭和迁移实验

迁移实验在具有8μm 孔径聚碳酸酯膜的24孔Transwell 小室中进行（购自BD 公司），侵袭实验在Matrigel 涂层的Transwell 小室中进行（购自BD 公司）。简而言之，将转染的膀胱癌细胞（5×104个/孔）用无血清培养基接种到上腔室中，并将含15%FBS 的培养基添加到下腔室中。温育24h 后固定、染色、计数。

1.7 流式细胞术

用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（购自Invitrogen 公司）处理5637 细胞。室温下黑暗中染色15min 后，将0.3ml 结合缓冲液添加到每个制备管中。用FACSCalibur 流式细胞仪（BD公司）测量细胞凋亡率。

1.8 裸鼠体内成瘤实验

该研究得到中日友好医院动物保护与福利委员会的批准。皮下注射肿瘤细胞到每组6 只小鼠的侧面皮下，注射后4 周处死小鼠。游标卡尺测量肿瘤的长度（L）和宽度（W），肿瘤体积（V）＝（L×W 2）×0.5。

1.9 统计学方法

取3 次独立重复实验的结果。应用SPSS17.0软件进行统计学分析，组间比较采用t 检验。

2 结果

2.1 LncRNA MIR100HG在膀胱癌中下调

首先，对5 例患者的临床样本进行了转录组测序（RNA-seq）（其中男3例、女2 例，年龄68±12.24 岁），根据|log2Ratio|≥1 和q＜0.05 筛选差异表达基因。分析结果显示，筛选出1752 个差异表达基因，其中1243 个上调而509 个下调（图1A，彩插二）。随后，我们对10 例患者的20 个样品进行了qRT-PCR 验证，发现MIR100HG 的表达显著下调（FC＝0.4，P＜0.01，图1B、C，彩插二）。通过探索基于从TCGA 数据库中提取的数据生物信息学数据库（starBase，http：//starbase.sysu.edu.cn/），分析膀胱癌中MIR100HG 的水平。与正常样本相比，MIR100HG在膀胱癌组织中呈下降趋势（FC＝0.16，P＜0.01；图1D，彩插二），与我们先前的研究结果一致。我们进一步对患者临床特征进行分析，MIR100HG 的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度或TNM 分期无关（均P＞0.05）。

图1 MIR100HG在膀胱癌中的表达情况

2.2 LncRNA MIR100HG在膀胱癌细胞中的表达情况

通过qRT-PCR 检测MIR100HG 在人膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）和5 种人膀胱癌细胞系（5637、EJ、BIU-87、SW780 和UM-UC-3）中的表达情况。我们观察到，与人膀胱上皮细胞系相比，MIR100HG 在人膀胱癌细胞系5637、EJ 和BIU-87 中的表达水平显著降低，而在SW780 和UMUC-3 细胞中，MIR100HG 的表达显著增加（P＜0.01，图2A）。为了研究MIR100HG在膀胱癌细胞中的功能，我们建立了稳定表达MIR100HG 的5637 和EJ 细胞。结果表明，MIR100HG 的表达水平显著高于对照5637 细胞或空载体5637 细胞（命名为pLOV 细胞，P＜0.01；图2B）。

图2 MIR100HG在膀胱癌细胞中的表达情况

2.3 LncRNA MIR100HG 过表达抑制细胞增殖

为探究MIR100HG 对体外膀胱癌细胞增殖和凋亡能力的影响，我们分别进行了CCK-8 和流式细胞实验。结果表明，过表达MIR100HG 显著抑制了5637 和EJ 膀胱癌细胞的增殖（P＜0.01，图3A、B），但对膀胱癌细胞的凋亡没有影响（P＞0.05，图3C-F）。

图3 过表达MIR100HG 对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

2.4 LncRNA MIR100HG 过表达抑制膀胱癌侵袭

行Transwell 实验以检测MIR100HG 对膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。结果表明，过表达MIR100HG 显著抑制了膀胱癌细胞的侵袭（P＜0.01；图4A，彩插二），但对膀胱癌细胞的迁移能力没有影响（P＞0.05；图4B，彩插二）。

图4 过表达MIR100HG抑制膀胱癌侵袭

2.5 HNRNPA2B1 的表达与lncRNA MIR100HG相关

用生物信息学数据库Starbase 分析可能与MIR100HG 相互作用的RNA 结合蛋白（RNA binding protein，RBP）。随后，我们对MIR100HG的潜在目标进行了初步筛选，共发现51 个目标（表1 示前5 个）。利用在线数据库GEPIA（gepia.cancer-pku.cn/）和UniProt（https：//www.uniprot.org/）逐一比较这51 个目标，发现HNRNPA2B1 可能与膀胱癌的发生发展有关。蛋白质印迹实验的结果表明，在过表达MIR100HG 的细胞中，HNRNPA2B1 的蛋白质水平被下调（图5A，彩插二）。这表明HNRNPA2B1 的表达可能与MIR100HG有一定相关性。

表1 RBP-MIR100HG 相互作用的前5 个目标

图5 MIR100HG与HNRNPA2B1相关性和裸鼠的体外肿瘤形成情况

2.6 LncRNA MIR100HG 过表达抑制裸鼠的肿瘤形成

我们使用皮下异种移植小鼠模型，评估MIR100HG 对裸鼠体内肿瘤生长的影响。分别注射5637 细胞和过表达MIR100HG 的5637 细胞到BALB/c Nu 小鼠的腋侧。注射后4 周，与对照组相比，MIR100HG 过表达组的肿瘤体积和重量显著降低（图5B、C，彩插二）。表明MIR100HG 在体内抑制膀胱癌肿瘤的生长。

3 讨论

膀胱癌预后不良和复发的问题，仍然是临床上的主要挑战。膀胱癌的病因涉及多种致癌基因和抑癌基因的变化。我们的研究证明了MIR100HG在膀胱癌中的作用。

3.1 LncRNA MIR100HG在膀胱癌中的表达模式及功能

越来越多的证据表明，MIR100HG 在各种人类肿瘤类型中均具有基因拷贝数变异。Yu 等进行了2 个非小细胞肺癌微阵列数据集的微阵列基因表达分析，发现与正常肺组织相比，MIR100HG在肿瘤组织中的表达水平降低了[6]。相反，Lu 等报道了在结肠直肠癌中MIR100HG 高表达，并与西妥昔单抗耐药有关[8]。Su 等人在骨肉瘤中，还发现MIR100HG 高水平表达，它通过LATS1 和LATS2的表观遗传沉默和Hippo 通路失活促进骨肉瘤的进展[9]。在急性巨核细胞白血病原始细胞中，MIR100HG 也呈现高水平表达。另外，Emmrich 等人的研究首次发现MIR100HG 在骨髓性白血病的发展中充当造血和致癌的调节剂[10]。所有这些结果充分证明了MIR100HG 与肿瘤细胞存活密切相关。

根据上述文献，我们想确定MIR100HG在膀胱癌中是否也有差异表达。我们对膀胱癌临床样品中MIR100HG 的表达进行了转录组测序。结果表明，MIR100HG 在肿瘤组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，并且在公共数据库获得了一致的结果。