贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下娃娃菜生长及软腐病防效的影响

耿 妍，张世昌，郭荣君，张爱香，Govrin Eri Moshe，李世东，沈瑞清，罗 明

（1.中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；2.河北北方学院，张家口 075000；3.宁夏农林科学院植物保护研究所，银川 750002；4.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052）

白菜是一种对水肥需求比较大的蔬菜，但是过量浇水施肥或者多雨造成地面积水、局部空气湿度过大、土壤缺氧不利于白菜生长，却利于软腐病菌的传播，加重白菜软腐病的发生[1]。该病一旦发生，轻者减产10%～20%，重者减产50%以上，甚至绝收[2]。在病害流行年份，其发病率高达30%～40%，我国大白菜每年因该病害损失近30万吨[3,4]。由于白菜软腐病病菌多存在于土壤中，因此控制浇水量是防控该病害发生的重要前提条件。如何解决其生长过程中对水肥的需求，又能控制软腐病的发生是生产中急需解决的问题。目前生产中主要采用 3%中生菌素可湿性粉剂拌种或 46%氢氧化铜水分散粒剂、50%氯溴异氰尿酸可湿性粉剂来防治白菜软腐病[5]。近年有研究报道一些生防菌剂对白菜软腐病具有较好的防治效果。如枯草芽胞杆菌菌粉拌种[4]、解淀粉芽胞杆菌B9601-Y2菌悬液淋灌[6]、穴施绿色木霉制剂等[7]，有些菌剂还具有促生效果。Tsuda等[8]从发酵食品中筛选得到的植物乳酸杆菌BY能显著降低白菜软腐病的严重程度。Shin等[9]从黄瓜和大白菜的根际分离出芽胞杆菌 H30-3，不仅可以促进白菜生长、缓解高温干旱胁迫，而且能显著降低由胡萝卜假单胞菌亚种引起的白菜软腐病的发病率。但目前有关水肥利用和生防菌施用防治白菜软腐病的研究尚未见报道。

水肥一体化灌溉技术改进了设施蔬菜传统水肥施用管理模式，使水、肥利用效率分别提高40%～60%和30%～50%[10]，有效防止了土壤盐渍化，降低了农田和食品的污染、改善农田生态环境，可节水节肥、省工增效[11]。已有学者开展了水肥与生防菌结合使用技术研究。贺超等[12]研究了AM真菌在不同水肥条件下对黄芩生长的影响，发现在土壤相对含水量50%，N、P、K施用量分别为 0.383 g/Kg土、0.564 g/Kg土、0.251 g/Kg土时，接种AM真菌的促生效应最佳。接种AM真菌不仅能够提高黄芩的耐旱性，提高其对水分和肥料的吸收利用，起到节水节肥的效果，还促进了黄芩生长和药用品质的提升。陆萍等[13]的研究表明，减肥10%时施用哈茨木霉和枯草芽胞杆菌复合生防菌剂效果最优，对哈密瓜蔓枯病防效为59.0%。耿妍等[14]研究了不同土壤水势下芽胞杆菌B006对茄子的促生作用结果表明，在土壤水势较低情况下，芽胞杆菌B006菌剂能促进茄子的生长和根系发育。

本研究通过盆栽试验进一步明确了贝莱斯芽胞杆菌B006对娃娃菜的促生防病作用。在此基础上应用水肥一体化技术，采用电子张力计监测土壤水势，研究不同土壤水肥供应量下，施用B006菌剂对娃娃菜生长发育、产量的影响，以期对浇水、施肥进行科学管理，在满足蔬菜优质高产的前提下，减少不合理的水肥投入，为芽胞杆菌制剂的合理应用及科学浇水施肥提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：贝莱斯芽胞杆菌BacillusvelezensisB006，中国农业科学院植物保护研究所土传病害防治组保存。

胡萝卜果胶杆菌Pectobacteriumcarotovorum，北京市农林科学院生物中心提供。

供试菌剂：贝莱斯芽胞杆菌B006菌剂，参考王军强[15]方法，在500 L发酵罐上发酵培养，管式离心机离心收集菌体，阴干后，得到干菌粉。活菌含量为1.5×1011CFU/g。

供试娃娃菜品种：京春黄3号，北京市农林科学院蔬菜中心提供。

田间小区试验地：北京市海淀区昌宁农庄日光温室。

水溶肥：N/P/K比例为18/5/13，含量36%，北京启高生物科技有限公司。

有机肥：有机质含量≥45%，北京启高生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盆栽促生试验 采用单因素随机区组交互试验设计，共8个处理（表1）。设置盆栽试验中水溶肥用量为5.09和3.57 g/kg土，分别与田间肥料用量1499.3和1049.5 kg/hm2相当；设置盆栽试验中土壤含水量为14%和20%，分别与田间土壤水势为−50和−30 kPa时的土壤含水量相当。

表1 盆栽试验不同处理水肥设计Table 1 Experimental design of different soil water content and fertilization conditions in pot experiment

从北京市海淀区昌宁农庄日光温室大棚采集土壤，前茬作物为玉米。称取1000 g土壤，放入内尺寸为215 mm×157 mm×70 mm的塑料盒中。按照表1设计，将不同用量的水溶肥按1: 500兑水稀释后与相应处理的土壤混和均匀。播种前在每种植沟撒入混有芽胞杆菌B006菌剂的基质土5 g（菌剂浓度为1×107CFU/g），再撒入种子，表层覆盖10 mm自然土。以只施用灭菌基质土为对照。每处理种植4盒，每盒播种3行。出苗前各处理含水量为20%，用保鲜膜覆盖保湿。待娃娃菜全部出苗时揭掉保鲜膜，然后间苗，每行7株苗，间距为25 mm。后期通过土壤称重并结合土壤含水量测定，控制土壤含水量分别为 20%和14%。出苗10 d后，调查娃娃菜的株高（cm）。

1.2.2 盆栽防病试验 试验处理同1.2.1。芽胞杆菌菌液和软腐病菌菌液准备：将贝莱斯芽胞杆菌B006和软腐病菌P.carotovorum分别接种到NB培养液中，30 ℃、180 r/min振荡培养18 h。镜检计数，将B006菌液稀释至3×108CFU/mL, 软腐病菌菌液稀释至1×108CFU/mL，备用。

娃娃菜出苗20 d后，进行防病试验。在处理P2、P4、P6和P8的娃娃菜植株叶柄基部先接种1 mL B006菌液（3×108CFU/mL），在处理P1、P3、P5和P7娃娃菜叶柄基部针刺接种1 mL无菌水作为对照，6 h后所有处理均接种1 mL软腐病菌菌液（1×108CFU/mL），每处理3重复。以仅接种无菌水的娃娃菜作为空白对照。25 ℃培养2 d后观察发病情况。

软腐病病斑分级标准：0级为R＝0；1级为0＜R≤10%；2级为10%＜R≤30%；3级为30%＜R≤50%；4级为 50%＜R≤100%，其中 R＝叶柄基部病斑长度×100%。病情指数＝∑（各级病株数×相对级数）/（总株数×最高级数）×100；防效（%）＝（对照平均病情指数－处理平均病情指数）/对照平均病情指数×100%。

1.2.3 日光温室试验 采用单因素随机区组交互试验设计，共8个处理（表2）。每小区面积为4.0 m×4.0 m，每处理3重复，共24个小区。采用电子张力计监测土壤水势，采用水肥一体化自动灌溉系统进行日常灌溉。播种前，施用14992.5 kg/hm2有机肥作为底肥，翻耕均匀。然后起垄，垄宽30 cm，沟宽20 cm。种植前先铺设滴灌管，每垄使用1条滴灌带，滴头间距为35 cm。将灭过菌的基质土与B006菌剂等比例混和，播种时穴施5 g菌剂（菌剂浓度为1×107CFU/g），以穴施等量的灭菌基质土与无菌水混和物作为对照。然后在菌剂上面播3～5粒娃娃菜种子，再覆土。每小区5垄，每垄16个种植穴，穴距20 cm。

表2 日光温室不同处理水肥试验设计Table 2 Experimental design of different fertigation conditions in the greenhouse

娃娃菜播种后，于每处理25 cm深处土层埋设电子张力计（北京市森雷科技有限公司），与娃娃菜植株水平距离为10 cm。根据电子张力计读数指示灌溉，当土壤水势达到-30、-50 kPa时开始浇水施肥。分别在幼苗期、莲座期和结球期追施水溶肥，T1、T2、T5和T6处理在全生长期内追肥量分别为1499.3 kg/hm2，其中各处理苗期追肥量为520.8 kg/hm2，莲座期和结球期追肥量为978.4 kg/hm2；T3、T4、T7和T8处理在全生长期内追肥量为1049.5 kg/hm2，其中各处理苗期追肥量为312.4 kg/hm2，莲座期和结球期追肥量为737.0 kg/hm2。T1～T4处理的实际灌水量为213.4 m3/hm2，T5～T8处理的实际灌水量为320 m3/hm2。

待第二片真叶全部长出后，从每小区选取五个点，每点选取3株，共15株娃娃菜，测定各处理娃娃菜的生长情况。采用便携式叶面积仪(型号：YMJ-B，浙江托普仪器有限公司)测量植株的第二片真叶面积（mm2）和叶宽（mm）。具体测量方法：将便携式叶面积仪的扫描区域对准叶片从上到下扫描，仪器自动生成叶面积和叶宽数据。收获时测定不同小区每行娃娃菜的重量（kg），计算每个处理的平均产量和单株重，并计算每公顷产量（kg/hm2）。收获后，采用五点取样法，从每个小区挖取30株娃娃菜植株的完整根系，测量其根长（cm）和根鲜重（g）。

1.3 数据统计与分析

采用Excel软件作图，采用IBM SPSS Statistics 20对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下盆栽娃娃菜的促生效果

对盆栽娃娃菜株高的调查结果（表3）表明：所有处理中，施用B006菌剂的处理P2、P4、P8与其相应的对照P1、P3、P7处理相比，娃娃菜株高明显增加（P＜0.05），但在土壤含水量为20%时，施用和未施用B006菌剂的P6和P5处理之间株高差异不显著。上述结果说明在较低水肥条件下，贝莱斯芽胞杆菌B006能促进娃娃菜生长。

2.2 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下盆栽娃娃菜软腐病的防病效果

不同水肥条件下，B006菌剂对娃娃菜软腐病的防效不同（表3）。土壤含水量为14%时（处理P1～P4），施用B006菌剂显著降低了娃娃菜植株的发病率和病情指数（P＜0.05），与未施用B006菌剂的对照相比，防效分别为68.3%和77.4%。土壤含水量和施肥量增加明显使娃娃菜软腐病的发病率增加，其中P5处理发病最重。在土壤含水量为 20%时（处理 P5～P8），B006菌剂的防病效果大幅度下降，仅达到27.1%～38.1%。

表3 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下盆栽娃娃菜生长和软腐病的防治效果Table 3 Plant growth and soft rot disease control of Chinese cabbage by B.velezensis B006 under different fertigation conditions

2.3 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下日光温室娃娃菜生长和产量的影响

播种25 d后，不同处理娃娃菜的长势不同。T1、T5处理植株长势较弱，T4处理（施用B006菌剂×土壤水势−50 kPa×施肥量1049.5 kg/hm2）的植株长势最好（图1）。T4处理与未施用菌剂且施肥量较高的T1和T5处理相比，叶面积分别增加了124.0%和72.0%，叶宽分别增加了40.0%和35.0%，差异显著（P＜0.05）（表4）。

图1 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下娃娃菜生长的影响Fig.1 Effect of B.velezensis B006 on the growth of Chinese cabbage under different fertigation conditions

表4 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下娃娃菜生长的影响Table 4 Effects of B.velezensis B006 on the growth of cabbage under different fertigation conditions

对收获后娃娃菜根系测量结果（表 4）表明：在相同水肥条件下，施用 B006菌剂的处理根系生长显著优于对照。在土壤水势为-50 kPa时，施用B006菌剂的T2和T4处理的根鲜重明显高于未施用菌剂的T1和T3处理（P＜0.05）；4个处理中仅T3与T4处理根长差异显著（P＜0.05）。土壤水势为-30 kPa时，各处理的叶面积和根鲜重差异不显著，T8处理根长与其他处理之间差异显著（P＜0.05）。上述结果说明低水肥条件下贝莱斯芽胞杆菌 B006能够促进娃娃菜的生长；而在高水肥条件下，贝莱斯芽胞杆菌 B006只对娃娃菜根系生长具有促生作用。

对娃娃菜产量的调查表明：不同处理对娃娃菜产量有一定影响（图2）。在所有处理中，未施用B006菌剂且高水平施肥（追肥量1499.3 kg/hm2）处理T5和T1（土壤水势分别为-30和-50 kPa）的产量较低，而低水、低肥并施用B006菌剂处理T4（土壤水势 -50 kPa×追肥量1049.5 kg/hm2）和高水、高肥并施用B006菌剂处理T6（土壤水势 -30 kPa×追肥量1499.3 kg/hm2）的产量显著高于T1和T5处理（P＜0.05）。与处理T5和T1相比，T4处理的产量分别提高了8.6%和11.2%。上述结果表明：在土壤水势为-50 kPa、追肥量1049.5 kg/hm2的低水、低肥条件下，施用芽胞杆菌B006菌剂仍能促进植株生长并提高产量，而单纯增加施肥量并不一定能促进植株生长和娃娃菜的产量，在实际生产当中需要合理施肥。

图2 贝莱斯芽胞杆菌B006对不同水肥条件下娃娃菜产量的影响Fig.2 Effect of B.velezensis B006 on the yield of Chinese cabbage under different fertigation conditions

3 讨论

娃娃菜是一种袖珍型小株白菜，在营养生长期间土壤水分和肥料施用对其生长有很大程度的影响，土壤水分匮缺会导致其生长不良，组织硬化，品质差；土壤水分过量则影响根系吸收营养和水分，也会造成生长不良，并加重病害的发生[16]。白菜软腐病是一种细菌性病害，土壤含水量是影响病害发生、发展的重要因素，浇水施肥量不当会加重白菜软腐病的发生[17]。本研究也发现土壤水分含量和施肥量均影响白菜软腐病的发生，特别是在土壤含水量为20%时、较高施肥量明显促进了软腐病的发生（T5 vs T7），发病率和病情指数明显增加，发病加重。因此在防治软腐病时，非常有必要将生物菌剂应用与田间浇水施肥相结合，以充分发挥生防菌剂的防病效果。

有关水肥用量与有益生物菌剂结合使用的研究已经有报道。贺超等[12]研究发现一定量的水肥与AM真菌配合使用可更好的发挥AM真菌的促生作用；较少化肥用量可促进木霉和芽胞菌复合菌剂的防病促生效果[13]；在同一施肥水平下，土壤水势较低时，芽胞杆菌B006菌剂更能促进茄子的生长和根系发育[14]。目前生产中主要以加强田间管理和使用化学农药防治白菜软腐病。本研究考查了不同施肥水平和不同水势条件下，贝莱斯芽胞杆菌B006对娃娃菜生长和产量以及防病作用的影响，发现无论较高土壤水势还是较低土壤水势情况下，高水平施肥都不利于植株生长并影响娃娃菜产量，这可能与施肥过高影响了土壤EC值和pH值，从而影响植株根系养分的吸收有关。在较低土壤水势且低水平施肥条件下，贝莱斯芽胞杆菌B006可以促进植株生长、有效减少白菜软腐病的发病程度，在田间还能够促进白菜增产，这与我们在茄子上试验结果类似[14]，将该试验结果应用于实际生产中可减水、减肥达11%左右。上述结果为改进芽胞杆菌菌剂的田间应用技术，更有效的提高芽胞杆菌的防病、促生和增产效果提供了依据，值得借鉴。

芽胞杆菌可产生多种次级代谢产物，不仅可促进植物生长，对多种病害具有良好的防治作用[18,19]，有关其在少水低肥条件下的促生、防病机理有待于深入研究。

4 结论

（1）生产中应合理浇水施肥，在土壤水势为-50 kPa、追肥量为1049.5 kg/hm2条件下，贝莱斯芽胞杆菌B006可以促进娃娃菜的生长并提高产量。

（2）娃娃菜软腐病的发病程度受土壤水分和施肥量的影响，在土壤含水量14%、施肥量为 3.57 g/kg土条件下，贝莱斯芽胞杆菌B006可显著降低娃娃菜软腐病的发病率和病情指数，提高芽胞杆菌的防病效果。