白背叶楤木愈伤组织诱导条件优化

张新军，吴瞾贤，吴银梅★，杨顺强，王世敏

（1 昭通学院，云南昭通 657000；2 盐津县第二中学，云南昭通 657000）

白背叶楤木（Aralia chinensis L.var.nuda Nakai）为五加科（Araliaceae）楤木属木本植物楤木（Aralia chinensis L.）的原变种，又称刺龙牙、刺嫩芽、刺苞、刺老苞等。本变种和原变种（楤木）的区别在于小叶片下面为灰白色，除侧脉上有短柔毛外余无毛，圆锥花序的主轴和分枝疏生短柔毛或几无毛，苞片呈长圆形，长6～7mm[1]。白背叶楤木在我国分布范围广泛，云南省主要分布于滇西北至滇中一带，在昭通市鲁甸县、大关县、镇雄县、彝良县、威信县比较常见，常野生于海拔1500～3000m 的湿润山坡林缘及水溪边。每年3—5 月，楤木顶芽萌发，顶芽外层包有5～7 片肉质化膜片，形成紫红色的鲜嫩芽苞，即为刺老苞，是珍贵的野生木本蔬菜。

同时，白背叶楤木具有药食兼用的效果。《滇南本草》记录：楤木能治风湿病、胃病，舒经活络、消肿止痛，树皮及根均有健脾养胃、促进排尿等作用。近几年研究表明：刺老苞含有丰富的药物活性成分，包括皂苷、萜类、黄酮、生物碱、鞣质，具有多种预防和治疗疾病的疗效[2]。作为蔬菜食用，新鲜的刺老苞可煮或炒，也可作干菜处理后食用，味道甘苦可口，营养物质丰富。李美娟等[3]测定了其营养成分，结果表明：其含有14 种氨基酸、10 种人体所需的常量元素和微量元素，是典型的高钾低钠保健蔬菜[4]，深受消费者喜爱，目前市场上供不应求[5]、经济价值高。

目前，国内外学者对于楤木属其它植物的研究主要集中在药理、营养价值等方面[6～9]，仅见该属另一种植物辽东楤木的组织培养研究报道[10]，而白背叶楤木相关研究未见报道。因此，可用正交试验优化愈伤组织诱导条件，为该资源的开发利用和种苗扩繁奠定基础。

1 材料

试验材料为野生白背叶楤木的嫩茎和嫩叶（采自云南省昭通市昭阳区骡马河水库旁林地）。

2 试验方法

2.1 消毒处理

选取健康完整、无损坏的嫩茎和嫩叶，用自来水冲洗2～4h 后，用细毛刷轻轻刷掉表面的泥尘杂物，再在超净工作台用75%酒精浸泡15s，用无菌水冲洗3 次。再用0.1%HgCl2处理3min，不断晃荡，用无菌水冲洗5次，将其放在培养皿中的滤纸上，用解剖刀将叶片切成1cm2的大小，将嫩茎切成长1cm 的茎段放入培养皿中，准备接种到MS 培养基中。

2.2 愈伤组织诱导

将处理好的外植体材料接种到添加有不同植物生长调节剂的MS 培养基中，每个培养基接种5 瓶，每瓶接种4 个。所有接种外植体诱导愈伤组织的培养基，放入人工培养箱中进行愈伤组织的发生，接种10d 后观察其启动情况，每隔5d 观察1 次，统计愈伤出现时间、愈伤数量、愈伤组织的颜色和形态及增长的高峰期。

2.3 培养条件

培养箱温度控制在（25±1）℃，光照强度为1500～2000Lx，湿度为60%，培养基pH 值为5.8～6.0。

2.4 数据分析

试验数据采用Excel 和SPSS 23.0 软件处理分析。

3 结果与分析

3.1 不同外植体出愈结果

在相同激素配比的MS 培养基中，嫩茎和嫩叶产生愈伤组织的时间不同，嫩茎在培养12d 后开始出现愈伤组织。嫩叶在培养15d 以后叶面内卷，开始出现愈伤组织，且质地较硬、色泽较茎的愈伤组织暗淡，容易出现褐化。嫩茎产生的愈伤组织大部分质地疏松柔软、组织面积大、色泽光亮，呈现黄绿色；嫩茎的愈伤组织诱导率最高达到100%，最低也有70%；嫩叶的愈伤组织诱导率最高为85%，最低只有20%。综上可知，白背叶楤木愈伤组织诱导最佳外植体为嫩茎。

3.2 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

3.2.1 不同激素配比对嫩茎愈伤组织诱导的影响。接种12d 后A2培养基中的外植体最早出现愈伤组织，其次是A1、A3、A4培养基出现愈伤组织。A1、A2、A3愈伤组织块较大，A4、A5、A7、A8培养基出现愈伤组织且较小，A4、A6、A9愈伤不明显。培养25d，愈伤组织的生长效果达到最佳，诱导情况（见表1），30d 以后，愈伤组织开始衰老和坏死。

表1 不同浓度激素配比对嫩茎愈伤诱导结果

首先，A1和A3愈伤组织生长状态相近，外表光滑、色泽明亮，呈现黄绿色，愈伤组织体积最大，生长效果最好，诱导率达100%，与其他组有明显差异。其次，以A2、A4和A6培养基诱导产生的愈伤组织最好，光泽明亮，呈黄绿色，3 个配方又以A2的愈伤效果最佳，诱导率达到100%。A7、A9的诱导效果最差，愈伤组织覆盖面积小，颜色为黄白色，上面出现大量白色颗粒状愈伤组织，表面干燥。

极差R 值越大，表示该因素影响也越大。由此可知，3 种激素对白背叶楤木嫩茎愈伤组织诱导影响为：6-BA＞2，4-D＞NAA。当6-BA 质量浓度为0.5mg/L时，愈伤组织诱导率最高，2，4-D 其次，并以1.0mg/L最佳，NAA 作用相对较小，以0.1 mg/L最好。因此，白背叶楤木无菌嫩茎的最佳诱导培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2，4-D0.1mg/L。

3.2.2 不同激素配比对嫩叶愈伤组织诱导的影响。将无菌嫩叶接种到不同浓度激素组合的MS 培养基中，25d后统计愈伤组织诱导情况（见表2）。

表2 不同浓度激素组合对嫩叶愈伤诱导的作用

接种10d 后，叶片开始卷曲，叶片增大；15d 后，叶脉、叶片切割处开始出现白色颗粒状愈伤组织。接种25d 时，愈伤组织快速生长，并出现褐化，30d 后褐化严重，并且开始死亡。

由表2 可知，A5和A2培养方案的愈伤组织出愈率最高，可达到85%、80%，愈伤组织大块，呈现黄绿色，在后期出现褐化；A9的出愈率最低，只有20%，愈伤效果最差，只在叶脉和叶柄处有小颗粒黄绿色愈伤组织，生长缓慢且愈伤启动时间也较晚。

通过分析，极差R 的值越大，表示该因素的影响越大。由此可知，对白背叶楤木嫩茎诱导愈伤组织的影响为：NAA＞6-BA＞2，4-D。萘乙酸的浓度增大，愈伤组织诱导率先增大后减小，当NAA 质量浓度为1.0mg/L时，愈伤组织诱导率最高，6-BA 对白背叶楤木组织愈伤诱导率的影响比NAA 较小，以1.0mg/L诱导效果最佳，2，4-D 影响最小，以0.2mg/L诱导效果最佳。因此，以无菌嫩叶为外植体诱导愈伤组织的最佳培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D0.1mg/L。

4 结论与讨论

本研究中，外植体嫩茎的愈伤组织诱导率高于嫩叶，且嫩茎出现愈伤组织的时间较早。接种第12d 出现愈伤组织，生长快速，愈伤组织呈现浅黄绿色，质地疏松。嫩叶出现愈伤组织时间比嫩茎晚，接种第15d 出现愈伤组织，愈伤组织生长缓慢，呈黄绿色、质地紧密。这一结果与赵恒田等[11]研究辽东楤木最佳外植体幼叶结果不同，这也说明同属不同种植物、不同外植体愈伤效果有差异；嫩叶愈伤的生长情况与孔凡芹等研究楤木胚状体的诱导结果相似[12]，且叶脉最先出现愈伤组织，这可能与叶脉作为物质运输和交换组织，最先受到激素刺激从而作出相应的反应有关[13-14]。

在本研究中，嫩茎的最佳诱导培养基为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.1mg/L；嫩叶的最佳诱导培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L。对比其它楤木属植物的研究，张云[15]关于棘茎楤木愈伤组织诱导和赵恒田等[11]关于辽东楤木愈伤组织诱导中，同样也用到6-BA、NAA、2，4-D 3 种激素，且诱导效果较好，说明6-BA、NAA、2，4-D 3 种激素对楤木属植物愈伤组织诱导具有极大的促进作用。除此之外，在云南楤木和龙牙楤木愈伤组织诱导中也均用到6-BA[16-17]。由此可知，6-BA 对楤木属植物愈伤组织诱导影响较大，这与6-BA 本身能促进细胞分裂，促进非分化组织分化的功能有关[18]。