苹果腐败菌的分离与鉴定

季春艳，段梦晴，曾雅倩，独梦蕊，刘生杰，2， 刘艳红

（1.阜阳师范大学 信息工程学院，安徽 阜阳 236037；2.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037）

苹果中含有丰富的营养物质，因其营养价值高为人们所喜爱，但富含营养也为腐败微生物滋生提供了良好条件，为苹果的贮藏保鲜带来难度[1]。影响苹果腐败变质的因素有很多，有物理因素、化学因素、生物因素等，其中微生物感染是导致苹果腐败变质的重要原因。只要环境适宜，病原菌侵染苹果后生长繁殖，分解吸收利用果实中的营养物质，来满足自身生长代谢的需要，苹果的营养成分被破坏，果实腐败并产生不良气味，失去了原有的感官品质和营养价值[2-3]。苹果的常见微生物侵染型病害有霉心病、轮纹病、青霉病等[4]。引起这些病害的主要微生物为青霉（Penicillium sp.）、链格孢菌（Alternaria sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）等，都是从碰、压、磕、刺伤或病虫害的部位侵入果实，引起苹果发病。苹果腐败变质严重阻碍了我国苹果产业的发展。

以市售常见红富士腐烂苹果为原料，对烂苹果上的微生物进行了分离，通过侵染试验验证分离菌株的致腐能力，并对该微生物进行鉴定，以期为深入研究致腐微生物对苹果的致病机理和保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

市售自然腐烂红富士苹果。

1.2 仪器设备

BPC-250F 型生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；T100P 型PCR 仪，上海兴曼生物科技有限公司产品；BM1000 型光学显微镜，德国Eppendof 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 分离可能的致病菌

挑选腐败的红富士苹果，切除苹果表面腐败组织作为样品，将25 g 果肉样品加入225 mL 灭菌水中，均质，按照10 倍系列稀释[5]。选择适当的稀释液，取1 mL 的稀释液涂抹在PDA 培养基上。培养1～2 d，再用平板划线方法分离纯化，连续纯化5～6 次，直至长出单个菌，将纯化的菌种置于4 ℃下保存[6-8]。

1.3.2 致腐能力测定

（1）孢子悬浮液制备。将已分离菌接种到PDA培养基上，在28 ℃下培养约5 d，挑取菌落孢子于无菌水中，用血球板计数，孢子悬浮液的质量浓度配制为1×105CFU/mL。

（2）接种。苹果→清洗→消毒（200 mg/L 次氯酸钠浸泡10 min）→70 %酒精喷涂苹果表面→晾干→在苹果果实的赤道部位用灭菌不锈钢铁钉（约4 mm）形成统一大小的创伤口。每个苹果随机选择3 个创口接种20 μL 孢子悬浮液，另一个创口接种等量的无菌水作为对照试验。

（3）菌斑直径的测量。接种后的苹果放置在28 ℃环境下培养，并每天观察和测量病斑直径，若苹果病斑直径大于2 mm 为腐败菌，反之不是腐败菌。

1.3.3 菌株的鉴定

（1）形态观察。挑取纯培养菌落，于光学显微镜下观察菌株形态特征，进行初步鉴定。

（2）微生物基因组DNA 提取与电泳检测。采用CTAB 方法提取基因组DNA，主要参照易庆平，冯广达等人[9-10]的方法，配制质量分数为0.7%的凝胶，电泳检测基因组DNA。根据电泳检测结果判断该菌基因组序列大小[3，11]。

（3）真菌ITS 序列测定与分析。将提取出来的DNA 产物送往北京睿博兴科生物技术有限公司测序，采用ITS 序列扩增通用引物ITS4，ITS5 进行PCR 扩增，从而鉴定分离纯化的菌的ITS 序列，将测得的序列通过BLAST 软件进行比对，并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离可能的致病菌

注射孢子悬浮液5 d 后的苹果腐败情况见图1。

图1 注射孢子悬浮液5 d 后的苹果腐败情况

2.2 致腐能力测定

注射孢子悬浮液后的病斑直径见图2。

图2 注射孢子悬浮液后的病斑直径

图1 是在同一个苹果上用灭菌不锈钢铁钉（约4 mm）形成统一大小的创伤口，4 个创伤口，如图1（a）（b）（c）（d），分别命名为孔1，2，3，4，其中孔1～3（a～c）是试验组，3 个孔分别接种质量浓度为1×105CFU/mL 的该菌孢子悬浮液20 μL 于28 ℃培养5 d，图1（d）为对照组，即接种等量的无菌水。图2 为接种后1～5 d 菌斑直径的测定结果。从图1 和图2 可以看出，该菌可以使健康苹果腐败，且病斑直径随着接种时间延长不断生长，根据科赫法则原理，可以确定分离出的菌株能够使苹果腐败。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 形态观察

对纯化后的菌进行形态学观察见图3。

图3 对纯化后的菌进行形态学观察

从苹果表面提取病料，接种至PDA 培养基，经分离纯化发现培养基上长出单个菌落，菌落较大、疏松、干燥，呈绒毛状，灰白色，可沿培养基表面蔓延生长（图3（a））。挑取单菌落边缘部分于载玻片上的无菌水中，在光学显微镜下（油镜下，10×100 倍）观察，可以看出有纤细管状的疑似菌丝的结构（图3（b）），从形态观察推测该菌株是真菌。

2.3.2 ITS 序列扩增及电泳

基因组DNA 电泳的检测结果见图4。

从纯化后的菌株中提取了7 管基因组DNA，编号为1～7，分别以7 管中的DNA 为模板，以真菌ITS 通用引物进行PCR 扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，从图4 中可以看出，1，2，4，5 这4 个管中序列DNA 条带明显，且DNA 序列大小在500 bp左右，这与真菌的ITS 序列片段长度一般在500～750 bp 相吻合，所以可以初步判断该菌株为真菌。

图4 基因组DNA 电泳的检测结果

2.3.3 真菌ITS 序列测定与分析

将提取出来的DNA 产物进行基因序列的测定，得到真菌的基因ITS 序列。

真菌ITS 测定序列见图5。

图5 真菌ITS 测定序列

将测得的序列通过BLAST 软件进行比对[12-17]，比对结果显示，菌株（命名为XXGC-1）与色二孢属基因序列的同源性高达99.34%，将测得的序列通过BLAST 软件与已知微生物比对构建系统发育树，在系统发育树中XXGC-1 与色二孢属Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）等菌能聚在一起（图6），表明菌株是色二孢属中一种。

基于ITS 序列构建的系统发育树见图6。

图6 基于ITS 序列构建的系统发育树

3 结论

对腐烂苹果上腐败菌分离、鉴定。通过平板分离纯化、苹果菌落特征观察、光学显微镜观察、ITS序列测定，及系统发育树构建，结果表明该菌种与色二孢属（Diplodia seriata）有99.34%的相似率，且与色二孢属Diplodia seriata CBS 112555（NR 111151.1）亲缘关系最近。通过侵染试验表明，该菌种具有致腐能力。致腐试验结果与原腐败现象基本一致、症状表现基本相同。

目前，从腐败苹果中分离并鉴定出的微生物主要有细菌和真菌，细菌有欧文氏菌（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、棒杆菌属（Corynebacteriurn）、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属等，真菌有青霉菌属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium）等，色二孢属在果蔬种植过程中较常见，如它能够引起葡萄藤顶端枯萎、藤蔓变白、芽体坏死及嫁接失败等症状。而对于色二孢属对苹果果实的致腐问题鲜有研究。

一般腐败霉菌侵入果蔬组织先附着在果蔬表面，孢子萌发产生芽管能够识别合适的渗透位置，然后形成附着胞和侵染垫等侵染结构，在侵染结构形成期间，逐渐代谢产生纤维素酶和果胶酶等细胞壁降解酶，腐败霉菌的主要致病因子是细胞壁降解酶和毒素，有的腐败菌也会增加苹果中促使果蔬发生褐变的关键酶的活性，如PPO 和POD 等，从而加速果实的褐变反应；有的腐败菌能够改变果蔬的风味物质，加快风味物质的代谢和挥发，改变与软化相关的关键酶的活性，如PG、PME、CX 酶等[3]。所以，推测试验分离的腐败菌可能有以上致病机理。试验存在一些不足之处，只对苹果上的腐败菌进行分离鉴定，且只分离鉴定出一种菌，未能分离出多种菌株，也无法解释该菌的致病机理，在此试验的基础上可以从以下几个方面进行深入研究：

（1）该菌种导致苹果腐败机理尚不清楚，还需要进一步检测相关指标，如坏果率、抗坏血酸含量、丙二醛含量、过氧化氢酶活性等，同时也可进一步检测相关抗性基因表达情况，从而进一步探寻该菌对苹果果实的致腐机理及苹果果实的应答机制。

（2）寻找能够抑制苹果中的色二孢属（Diplodia seriata）的方法，并通过感官评价和相关指标的测定证明该方法安全有效。

（3）在腐烂的苹果上再分离纯化多个菌种，并探寻它们的致病制腐机理，也可从其他腐烂水果上分离鉴定菌种，并探寻其致病或致腐机理。

（4）探寻苹果保鲜方法，找到抑制有害微生物生长繁殖的安全可行的方法。但是，由于其中的微生物种类多，影响因素繁多，环境条件也变化多端，存在许多不定的因素，且不同微生物之间也会相互影响。因此，探寻最佳苹果保鲜效果是需要大量的试验数据和实践经验的，还需进一步深入研究。