基于与铁死亡相关基因的肺腺癌的新型预后模型构建

张祥鑫，董星星，耿 涛，赵伯文，魏育涛

（1.石河子大学医学院，新疆 石河子 832008；2.石河子大学医学院第一附属医院心胸外科，新疆 石河子 832008；3.济宁市第一人民医院，山东 济宁 272000）

根据2020 年最新的GLOBALCAN 统计数据显示，全球186 个国家36 种癌症中乳腺癌发病率高居首位，但肺癌则是导致癌症死亡的首要原因。全球预计新增220 万肺癌病例，180 万例患者因肺癌而死亡[1]。肺腺癌是一种常见的非小细胞肺癌，约占非小细胞肺癌的50%[2]。虽然早期通过手术治疗的肺腺癌可以或得较长的生存期，但是总体的5 年生存率仅为18%[3]。铁死亡是一种Dixon 在2012 年发现的一种程序性细胞死亡，且有别于细胞的凋亡和坏死[4]，铁死亡的发现促使人们对于肿瘤疾病的发生发展有了新的认识。目前研究发现，许多药物可以通过诱导肿瘤细胞铁死亡达到抑制肿瘤的增殖与转移的目的，因此铁死亡相关基因有希望成为未来治疗肿瘤的新靶点[5-7]。本研究基于TCGA 公共数据库中肺腺癌基因表达谱及临床相关数据进行联合分析，利用R 语言软件筛选出与铁死亡相关差异基因，利用单、多因素Cox 分析构建预后风险预测模型，并进一步评估了模型中基因与临床病理特征之间的相关性，并对其应用于肺腺癌的预后预测。

1 资料与方法

1.1 数据来源 本研究肺腺癌相关数据均通过TCGA（https://cancergenome.nih.gov）数据库公开获取。

1.2 差异表达分析 根据GENCODE 项目（https://www.gencodegenes.org/）[8]中的基因注释，对肺腺癌患者相关RNA-seq 数据进行编码蛋白质的基因谱数据分类。运用R 语言中的“limma”[9]包对TCGA 数据库中的蛋白编码RNA-seq 数据进行分析，参照|logFC＞1|及P＜0.05 的筛选标准，获取肺腺癌组织和正常肺组织中的差异表达基因。结合既往文献中铁死亡相关的基因，在获得的肺腺癌组织和正常肺组织中的差异表达基因列表中进一步提取铁死亡相关基因，最终获得铁死亡相关的差异表达基因。

1.3 富集分析 通过使用R 包中的“clusterProfiler”[10]和“org.Hs.eg.db”对筛选得到的铁死亡相关差异表达基因进行GO 和KEGG 分析，以鉴定功能丰富的基因并分类基因簇。其中，GO 主要涉及生物学的三个方面：细胞成分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）。KEGG 用于探索DEGs 所涉及相关通路。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

1.4 预后风险预测模型的构建 通过对铁死亡相关的差异表达基因进行单因素Cox 回归分析，得到与患者生存相关的基因，P＜0.05 被认为差异具有统计学意义并纳入多因素Cox 回归，用于建立预后风险预测模型，计算不同患者的风险评分，依据评分不同，将患者分为高、低风险组，并进行验证。

1.5 临床病理相关性分析 通过运用R 软件中的“survival”[11]包，联合患者的临床病理特征（年龄、性别、TNM 分期以及Stage 分期）对模型中的基因进行单因素及多因素的分析，分析模型中的基因与临床病理特征之间的关联性。

1.6 统计学分析 本研究中的分析均通过R 软件3.6.2 版本完成，其中“limma”包进行差异基因获取，“clusterProfiler”和“ org.Hs.eg.db”用于进行功能富集分析，“survival”包用于进行Kaplan-Meie 生存分析。

2 结果

2.1 铁死亡相关差异表达基因的获取 通过分析TGCA 数据库中所下载的535 例肺腺癌组织和59例正常肺组织的表达数据，共得到差异表达基因3843 个，其中铁死亡相关差异表达基因63 个，包括上调基因42 个，下调基因21 个，见图1。

图1 肺腺癌组织和正常组织中得到的差异基因

2.2 富集分析 通过对差异表达的铁死亡相关基因进行富集分析发现，在功能上，基因主要涉及与氧化还原酶活性（作用于NADPH，氧为受体）、铁离子结合及氧化还原酶活性（通过结合分子氧作用于单个供体相关），并且通过对KEGG 信号通路进行分析发现，差异基因主要涉及到以下通路：铁死亡通路、HIF-1 信号通路及谷胱甘肽代谢等，见图2。

图2 铁死亡相关差异基因的富集分析

2.3 预后风险预测模型的构建 对筛选出的铁死亡相关的63 个差异表达基因进行单因素Cox 回归分析，共发现了与预后相关的15 个基因，分别为NOX1、ALOX12B、CHAC1、TXNRD1、GPX2、DDIT4、SLC7A5、TRIB3、IL33、SLC2A1、RRM2、AURKA、GCLC、FANCD2、CAV1。将该15 个基因纳入多因素Cox 回归分析，构建了基于NOX1、ALOX12B、SLC2A1、RRM2 和CAV1 的预后风险预测模型：风险评分=0.234×NOX1+0.229×ALOX12B+0.006 ×SLC2A1+0.019×RRM2+0.003×CAV1，见表1。

表1 多因素Cox 回归模型中的5 个基因

2.4 临床病理相关性分析 单因素Cox 回归分析显示，RS 评分、TNM 分期以及stage 分期与患者的预后相关。然而，多因素Cox 回归分析进一步显示，在针对年龄、性别、TNM 阶段等临床特征进行调整后，只有RS 评分与肺腺癌患者的预后密切相关，见图3。此外，该预测模型中NOX1 的表达与N 分期及性别相关；RRM2 与年龄、性别、N 分期、M 分期及stage 分期具有相关性；SLC2A1 与年龄、性别、T 分期、N 分期及stage 分期具有相关性；RS 评分与较差的N 分期及stage 分期相关，见图4。

图3 单因素和多因素独立的预后分析

图4 预测模型构建基因的表达与临床病理特征的相关性分析

图4（续）

2.5 预后模型的评估 根据K-M 生存分析结果显示，与低风险组相比，高风险组拥有较差的预后（P=8.449e-06），绘制模型的ROC 曲线，线下面积为0.682。模型中RS 评分与相关基因表达热图及生存时间点图见图5。

图5 RS 评分与相关基因表达热图及生存时间点图

图5 RS 评分与相关基因表达热图及生存时间点图

3 讨论

自2012 年Dixon 首次提出铁死亡概念后，铁死亡开始成为医学研究的热点。铁死亡主要影响细胞代谢方式改变而发生，研究者发现，铁死亡被抑制的现象在肺癌中普遍存在。相关研究发现，在肺癌细胞中，增加GPX4 的表达可以抑制铁死亡的发生[12]。虽然肺癌铁死亡的分子机制尚不清楚，但通过调节肿瘤细胞铁死亡的发生有望成为一种新的肿瘤治疗方法。

本研究通过TCGA 数据库中肺腺癌的相关数据，构建了由NOX1、ALOX12B、SLC2A1、RRM2 和CAV1 五个基因组成的风险预测模型，且5 个基因均为危险因素。结合临床病理分析，该模型可作为肺癌预后的独立预测指标，且NOX1、SLC2A1 及RRM2 与患者的临床病理特征具有相关性。

NADPH 氧化酶1（NOX1）具有产生反应性氧化物质的功能。多项研究表明，高水平表达的NOX1与肿瘤患者的不良预后相关，如肝细胞癌[13，14]、肝胆管癌[15]以及胃癌[16]。此外，研究人员发现NOX1 还与细胞增殖、肿瘤生长、细胞运动、上皮-间质转化（EMT）和基质金属蛋白酶-2 的产生相关[17，18]。因此，针对NOX1 进行的靶向干预可能有助于开辟人类肿瘤治疗的新途径。

溶质载体家族2 成员1（SLC2A1）是一种控制葡萄糖吸收的葡萄糖转运蛋白编码基因，其编码的蛋白与葡萄糖代谢密切相关。由于肿瘤细胞的增殖与生长需要依靠糖酵解以及氧化磷酸化来产生能量[19]，因此SLC2A1 可能在肿瘤细胞的生长和增殖中起着关键作用。SLC2A1 的高表达与不同类型的恶性肿瘤相关，尤其是由致癌性KRAS 和BRAF 突变或p53 缺失驱动的恶性肿瘤，从而促进了癌细胞的增殖[20-22]。研究表明，SLC2A1 的高表达与结肠癌，肺癌，乳腺癌和口腔癌的预后较差有关[19,22,23]。

核糖核苷酸还原酶M2 亚基（RRM2）与DNA的损伤修复存在关联性，并在多种肿瘤组织中高表达。多项研究表明，RRM2 的高表达水平与细胞迁移和侵袭密切相关，对肿瘤转移和预后产生一定的影响[24,25]。此外，RRM2 的高表达被认为与化疗药物的耐药性有关，敲低RRM2 的表达可提高肿瘤细胞的对化疗的敏感性[20]。

ALOX12B 基因位于染色体17p13.1，包含15 个外显子，编码脂氧合酶。据报道脂氧合酶与包括肿瘤在内的多种疾病有关[26]。如ALOX15 通过抑制大肠癌中的IL-6/ STAT3 信号传导途径来抑制炎症[27]，还可以通过调节PI3K/ ERK1 信号通路促进宫颈癌的致癌作用[28]。

Caveolin-1（CAV1）是细胞膜上的一类支架蛋白，已被证实与肿瘤发生和恶性发展密切相关。多项研究表明CAV1 表达升高可促进各种癌症细胞的增殖、分化和迁移，如肺癌、乳腺癌[29]。在接受放射治疗的NSCLC 脑转移患者中，观察到CAV1 表达较高组中死亡风险增加[30]。

总之，本研究成功构建了肺腺癌预后的风险预测模型，发现NOX1、SLC2A1 及RRM2 与患者的临床病理特征具有相关性，可为后期研究治疗靶标提供理论依据。然而本研究也具有一定的局限性，模型的预测能力仍需多个不同数据库的验证，另外本实验缺乏相关的基础实验予以验证。