泰山紫草对免疫性血小板减少性紫癜的治疗作用研究

阴祖旺，李明亮，毛双双，葛 雪，史文峰，郑红丽，刘有旺

（山东第一医科大学公共卫生学院，山东 泰安 271000）

免疫性血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）是临床常见的出血性疾病，一般表现为皮肤、黏膜自发性出血，血小板减少，出血时间延长。目前临床通常采用输血、输入血小板并联合采用泼尼松激素和环磷酰胺治疗[1]。但输注血小板存在感染血源性疾病的风险，反复输血或血小板使机体诱发同种异体免疫反应，产生溶血反应或破坏输注的血小板等。激素及免疫抑制剂长期使用副作用大且有一定的复发率。中药治疗免疫性血小板减少性紫癜是目前的发展趋势和研究热点。泰山紫草是泰山名药之一，有活血、凉血、清热解毒等功效[2-4]，但该药材对免疫性血小板减少性紫癜的作用及机制尚不清楚。本研究拟探究泰山紫草对ITP 的治疗效果及机制，旨在为临床治疗免疫性血小板减少性紫癜提供治疗选择。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康8 周龄雄性BALB/c 小鼠，60只，鼠龄8 周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。健康雄性Hartley Guinea Pig 豚鼠，6 只，6 周龄，体重300～400 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本研究经山东第一医科大学动物伦理委员会审核通过。

1.2 仪器与方法 试剂弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国Sigma 公司，小鼠IL-2 和IL-10ELISA 试剂盒购自美国赛默飞公司，小鼠血小板生成素ELISA 试剂盒购自上海酶联生物，FITC Anti-MouseCD41 抗体购自美国Biolegend 公司，泰山紫草购自泰安市泰山四大名药开发有限公司，醋酸泼尼松龙注射液购自华中药业股份有限公司。本研究用到的主要仪器有酶标仪（赛默飞世尔，Multiskan FC）、离心机（美国Sigma 公司，3-16L）；血细胞分析仪（日本光电公司，MEK6318K）；流式细胞仪（美国BD 公司，FACS Aria II）。

1.3 方法

1.3.1 血清制备 麻醉小鼠，眼眶采血，EDTA 抗凝，1000 rpm 离心10 min，取富含血小板的上清，3000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀用PBS 洗3 次，用生理盐水配成1×109个/ml 血小板悬液，与等量弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化混匀制备豚鼠抗小鼠血小板血清（Guinea pig anti-mouse platelet serum，APS）。第1 周给豚鼠皮下注射含弗氏完全佐剂的血小板悬液1 ml，然后连续4 周每周皮下注射含弗氏不完全佐剂佐剂的血小板悬液1 ml，第6 周心脏采集豚鼠全血，3000 rpm 离心10 min，取上清，此即为豚鼠抗小鼠血小板血清。经腹腔注射血小板，隔30 d 进行2 次注射后分离豚鼠血清备用。

1.3.2 模型建立 将上述制备的豚鼠抗小鼠血小板血清用生理盐水以1∶4 稀释，隔天腹腔注射BALB/c 小鼠，每只每次100 μl，共19 d 建立免疫性血小板减少性紫癜（ITP）模型。

1.3.3 动物分组及给药 于造模后第7 天开始分组给药。将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、泰山紫草汤低、中、高剂量组和激素组，每组10 只。正常对照组小鼠不作任何处理，泰山紫草汤低、中、高剂量组于造模后给予自制泰山紫草汤，其中低、中高3 个剂量的用量分别为5 mg/20 g、10 mg/20 g、20 mg/20 g，激素组于造模后给予醋酸泼尼松龙治疗0.4 mg/20 g，模型组于造模后给予等体积蒸馏水。各组均灌胃给药，1 次/d，共给药14 d。

1.3.4 指标检测 小鼠眼眶取血，EDTA-Na2 溶液抗凝。血细胞分析仪检测外周血中血小板数量。5 μl抗凝血加50 μl TO 工作液和5 μl CD41-FITC 抗体，室温避光孵育15 min 后，流式细胞仪检测网织血小板比例。吸取每只小鼠100 μl 血清样品，酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别测定血清中IL-2、IL-10 和血小板生成素（thrombopoietin，TPO）含量。ELISA 操作按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行分析，实验数据用（）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q 检验，以P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 泰山紫草对ITP 模型小鼠外周血血小板计数和外周血网织血小板比例的影响 模型组外周血血小板数低于正常对照组，网织血小板比例高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；激素组血小板数高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组血小板数高于模型组，且呈剂量依赖效应（P＜0.05），且与正常对照组接近；泰山紫草汤低、中、高剂量组网织血小板比例均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组网织血小板比例和激素组接近，无明显差异（P＞0.05），见表1。

表1 泰山紫草对ITP 小鼠外周血小板计数和对网织血小板百分比的影响（）

表1 泰山紫草对ITP 小鼠外周血小板计数和对网织血小板百分比的影响（）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

2.2 泰山紫草对ITP 模型小鼠骨髓细胞IL-2、IL-10、TPO 含量的影响 模型组血清IL-2 水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组和激素组IL-2 水平均明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组IL-2 水平与激素组水平接近，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组血清IL-10 含量低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组IL-10 水平高于模型组和激素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组小鼠血清TPO 含量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组TPO 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泰山紫草汤低、中、高剂量组TPO 水平与激素组水平接近，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 泰山紫草对ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影响（，pg/ml）

表2 泰山紫草对ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影响（，pg/ml）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与激素组比较，cP＜0.05

3 讨论

ITP 是与感染、药物、遗传等多种原因有关的自身免疫异常引起的疾病[5]。泰山紫草对ITP 的疗效及作用机制尚不十分清楚。本研究建立了ITP 小鼠模型，通过泰山紫草汤灌胃治疗，发现泰山紫草汤能有效提高外周血血小板数量，改善血小板减少的症状，降低血小板代偿性增殖程度。表明泰山紫草汤对ITP 有治疗作用。

研究显示，体内细胞因子失调在ITP 发病过程中起着重要的作用[6-8]。细胞因子可调节免疫应答的类型，参与人体的炎症和免疫反应。在ITP 患者体内发现多种细胞因子的水平异常，如白细胞介素（Interleukin，IL）-2、IL-10 和转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等[8，9]。其中IL-2 主要是由Th1 细胞分泌的一种促炎性细胞因子，可以促进T细胞增殖，并促使B 细胞增殖、分化为浆细胞，产生大量抗血小板抗体，进而导致血小板减少[10]。本研究发现，泰山紫草汤可以降低ITP 模型小鼠体内IL-2含量，疗效接近醋酸波尼松龙，推测其具有抑制T细胞的增殖、分化及B 细胞生成血小板抗体，减少血小板免疫性破坏、从而达到提高血小板数量的作用。细胞因子IL-10 主要由Th2 细胞分泌，并能抑制Th1 细胞分泌的一种抑炎性细胞因子[11]。本研究表明泰山紫草汤可以升高ITP 模型小鼠体内IL-10 含量，疗效优于醋酸波尼松龙。推测其可能抑制B 细胞产生大量抗血小板抗体，进而引起血小板增加。综合对泰山紫草汤对IL-2 的抑制作用和对IL-10的促进作用，推测泰山紫草汤可能通过调节促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子的平衡，进而调节抗血小板抗体的产生，最终达到治疗ITP 的作用。本研究结果也与相关研究报道相一致[6，7]。

TPO 是与血小板数量和抗血小板抗体最密切相关的指标[12，13]。TPO 泰山紫草治疗后与模型对照组比较，各用药组TPO 水平均降低，表明泰山紫草汤能明显降低ITP 模型小鼠体内TPO 浓度，推测抗血小板抗体减少后，血小板升高，进而促进了外周血中TPO 的摄取、利用和降解，使血清TPO 浓度下降，与相关研究报道相一致[9，12，13]。

尽管本研究取得初步结果，但由于实验条件限制，未系统研究多种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的变化及其与抗血小板抗体之间的直接联系，在以后的工作中，将深入研究泰山紫草汤的免疫作用机制。总之，本实验为ITP 在新药研制方面提供理论依据，为ITP 治疗提供新思路。