大鲵虹彩病毒和嗜水气单胞菌混合感染的诊疗

李亮亮，孙乐天，张 卓，卫泽珍

（太原动物园，太原 030009）

大鲵（Andrias davidanus）俗称娃娃鱼，属于两栖纲脊索动物门有尾目隐鳃鲵科大鲵属，是现存最大的两栖动物，体长1 m左右，最长可达2 m，体重20～25 kg[1]，为国家重点Ⅱ级保护野生动物，世界自然保护联盟（International union for conserva⁃tion of nature，ICUN）红色名录中为极危级（CR级），具有重要的研究价值。近年来由于环境等原因造成野生大鲵的数量急剧减少[2]。

大鲵虹彩病毒（Andrias davidianusiridovirus,ADIV）属于蛙病毒属（Ranavirus）成员，为双股DNA病毒。感染该病毒后发病速度快、传染性极强，幼鲵病发致死率可高达100%，成鲵死亡率亦在90%以上，在陕西[3-4]、贵州[5]报道发生过大鲵虹彩病毒感染，并且造成大鲵大量死亡，目前尚无有效的治疗方法[6]。2017年9月—11月份，山西某地饲养的大鲵陆续有7只死亡，体表和四肢可见多处溃烂、充血及出血。解剖可见肝脏肿胀、脾脏上有针尖状的白点，肠道上有弥漫性出血。经实验室检测，诊断为嗜水气单胞菌和大鲵虹彩病毒混合感染。通过有效的防治措施，大鲵病情得到有效控制。现将诊治过程报道如下。

1 病料的采集及相关耗材

1.1 病料的采集

病料采集于山西省某单位。大鲵死亡后立即采集病料，放于自封袋内，置于-20℃冰箱中冻存。

1.2 主要试剂

常规药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司产品；DNA Marker、Ex Taq，宝生物工程（大连）有限公司产品；基因组提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品。

1.3 主要仪器

PCR仪，美国MJ公司产品；多用途电泳仪，北京六一仪器厂产品，DYY-12型凝胶成像分析系统，美国UVP公司产品。

1.4 引物的合成

根据虹彩病毒主要核衣壳蛋白（MCP）基因序列设物，引物序列为如下，F：5'-GACTTGGCCACT⁃TATGAC-3'，R：5'-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3'，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

2 实验室检测

2.1 细菌分离培养及染色镜检

无菌条件下采集肝脏组织，划线接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和血平板培养基上，置于37℃培养24 h，然后挑取单个菌落进行革兰染色及镜检；另外，挑取单个菌落划线进行纯化培养。

在普通营养琼脂平板上，菌落呈淡黄色、边缘整齐、微凸、圆形。

经革兰氏染色后，在镜下观察，可见菌落为革兰氏阴性，形状呈短杆状，略呈弧状，两端钝圆，单个分散排列。

2.2 药敏试验

采用纸片扩散法进行药敏试验，药敏结果以抑菌圈直径（mm）作为判断标准。选择10种常规药敏纸片法测定抗菌素对分离菌株的抗药谱，接种分离菌株，然后将药敏纸片贴在培养基上，置于37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

分离菌株对10种药物的敏感性试验结果见表1。由表1可知，该菌株对头孢曲松钠、恩诺沙星敏感，对阿米卡星和复方新诺明中度敏感，对青霉素、庆大霉素、氟苯尼考、卡那霉素、氨苄西林和阿莫西林具有耐药性。

表1 药敏试验结果

2.3 细菌生化试验

挑取普通营养琼脂平板上可疑的菌落，再接种到普通营养琼脂平板上，置于培养箱中37℃，培养24 h后，挑取2个菌落到2 mL 0.9%的生理盐水中，制成McFarland（麦氏比浊法）0.5浊度的菌悬液，再用灭菌管接种到生化发酵管内，石蜡封口。于培养箱中37℃培养，24 h后进行判定。

生化试验结果见表2。由表2可知，分离的细菌能够使葡萄糖产气，发酵甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、水杨苷，不能发酵乳糖和肌醇，水解七叶苷，吲哚试验为阳性，V-P试验为阳性，鸟氨酸脱羧为阴性。与第8版《伯杰氏细菌鉴定手册》对照，符合的嗜水气单胞菌生化鉴定特征。

表2 生化鉴定结果

2.4 PCR检测

称取病死大鲵的肝脏组织1 g，利用基因组DNA提取试剂盒提取DNA。预期扩增片段大小为510 bp。PCR反应总体积为20 μL，包括10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Mix 8 μL，去离子水10 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；最后72℃再延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

从患病大鲵肝脏组织提取的基因组中均扩增出约510 bp的DNA片段，见图1，与预期结果一致。将扩增产物送至生工生物工程（上海）有限公司测序，将测序结果在NCBI数据库中进行比对分析，结果发现该序列和GenBank中虹彩病毒的主要核衣壳蛋白编码基因有高度同源性，核苷酸相似性达98%，确定患病大鲵感染虹彩病毒。

图1 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测结果

3 诊断

根据发病情况、临床症状、解剖结果和实验室检测，确断患病大鲵为嗜水气单胞菌和大鲵虹彩病毒混合感染。

4 防治措施

用聚维酮碘对饲养环境和用具进行彻底的消毒。患病大鲵进行单独隔离饲养，肌肉注射头孢曲松钠进行治疗。

对未发现症状的大鲵进行预防：首先使用1‰高锰酸钾或2%聚维酮碘浸泡30 min，然后再加入黄芪多糖、维生素C、头孢曲松钠、电解多维进行浸泡。对投喂的泥鳅用2%聚维酮碘浸泡30 min，冲洗干净后再投喂。经过上述方法预防后，病情达到有效的控制。

5 讨论

嗜水气单胞菌广泛存在于自然界的水域中[7]，是一种条件性致病菌，引起鱼类及其他水产动物发病的一种重要的致病菌[8-11]。当环境温度过高时，容易使水体内营养成分过剩，造成水体污染，嗜水气单胞菌会大量的繁殖，由于环境的恶化造成，动物机体抵抗力下降，从而造成嗜水气单胞菌入侵机体引发动物感染[12]。同时当饲养密度过大、养殖水体循环缓慢，从而为嗜水气单胞菌的增殖和感染提供了有利条件。

已经有多名研究者相继报道了大鲵感染蛙虹彩病毒和（或）嗜水气单胞菌[3-4]，对大鲵的养殖场造成很大的危害。大鲵虹彩病毒感染后死亡率达90%以上，并且还没商品化的疫苗可以使用[6]。因此在日常生活中加强饲养管理，做好饵料的消毒和新引入大鲵的隔离检疫工作。

同时需要建立大鲵疾病的快速诊断技术，来指导临床上的疾病治疗。在本例病例上，细菌的鉴定采用了传统的形态学鉴定和生化试验相结合的方法，同时进行药敏试验来为临床治疗工作提供指导。使用了PCR技术对大鲵虹彩病毒进行了检测，该方法操作简单、成本低廉，敏感性高，结果准确，容易推广。鉴于该病的传染性强、死亡率高，可以对新引入的大鲵，利用PCR技术进行检测，虹彩病毒确定为阴性后方可混养。