云南省马铃薯春作区晚疫病菌对甲霜灵敏感性测定

钱红洁，刘 霞，郭 琳，张 哲，李贵吉，杨 俐，杨艳丽

(1.云南农业大学 植物保护学院，昆明 650201 2.会泽县驾车乡农业技术推广站，云南会泽 654218 3.大理市植保植检站，云南大理 671003)

马铃薯晚疫病是由卵菌纲致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]引起的毁灭性病害，一般年份可导致马铃薯减产10%～20%，发病重的年份可减产50%～70%，甚至绝收。防治马铃薯晚疫病的措施有种植抗病品种、种薯消毒、化学防治、生物防治、加强田间栽培管理以及预测预报等，其中最经济有效的是种植抗病品种。由于近年来各产区种薯的频繁调运，加之晚疫病菌极易发生变异，特别是A2交配型出现以后，垂直抗性品种容易丧失抗性，当晚疫病大面积发生时主要依赖化学防治[1-2]。甲霜灵为苯基酰胺类杀菌剂，是防治晚疫病的有效药剂之一，1977年在生产上推广应用，该类药剂对马铃薯晚疫病有很好的防治效果，具有保护兼治疗的作用[3]。但长期大量施用该药剂，易使病原菌产生抗药性[4]。1981年Davidse等[5]和Dowley等[6]首次报道在荷兰和爱尔兰发现甲霜灵抗性菌株，随后全球各地区均有报道。在国内，1998年李炜等[7]首先报道采自河北、黑龙江、内蒙古、甘肃等地的马铃薯晚疫病菌甲霜灵敏感性情况。2010年以来，全国各省马铃薯产区甲霜灵抗性菌株比例呈逐年上升趋势[8-10]。2018年霍超等[11]报道云南省昆明市马铃薯主产区甲霜灵抗性菌株比例高达100%。但其采集地点和试验样本量有限，不能真实反映云南省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵敏感性的现状，目前仍缺乏对云南省马铃薯晚疫病菌甲霜灵敏感性情况的系统深入研究。本研究对2018-2020年采自云南省马铃薯春作区晚疫病菌进行甲霜灵敏感性测定，明确其甲霜灵抗药性水平，为科学防治马铃薯晚疫病提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试马铃薯晚疫病菌共301株，由2018-2020年采自云南省春作区的马铃薯晚疫病样品分离纯化所得(表1)。

供试菌株编号规则：地点+寄主品种+(海拔)+编号。

1.2 供试药剂

98%甲霜灵原药，购自阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲亚砜(DMSO)，购自上海生工生物有限公司。

1.3 供试培养基

黑麦番茄培养基(1 L)：将番茄洗净去皮用榨汁机打碎，加水1∶1稀释，分装至锥形瓶中，高压灭菌锅101 kPa、120 ℃灭菌30 min，待番茄汁冷却后放入4 ℃冰箱中保存，备用。称取50～60 g黑麦，加适量的水进行高温灭菌30 min。将已灭菌的黑麦加水榨汁机打碎，加热煮沸后过滤，取滤液850 mL，加入150 mL番茄汁，1.2 g CaCO3及琼脂17 g，pH调为6.5～7.0，分装至锥形瓶中，高压灭菌2次。倒平板，备用。

含甲霜灵质量浓度为5 μg/mL、100 μg/mL的黑麦番茄培养基：98%甲霜灵原药用灭菌的二甲亚砜溶解后配成100 mg/mL的母液，按上述方法做好黑麦番茄培养基，灭菌后冷却到50 ℃，取定量母液与黑麦番茄培养基混匀配成所需质量浓度的含药培养基，摇匀，倒平板，备用。

含二甲亚砜50 μL/L、1 mL/L的黑麦番茄培养基：按上述方法做好黑麦番茄培养基，灭菌后冷却到50 ℃，取定量二甲亚砜与黑麦番茄培养基混匀配成所需体积分数的含药培养基，摇匀，倒平板，备用。

1.4 甲霜灵敏感性测定

晚疫病菌甲霜灵敏感性测定采用菌落直径法[12]。先用5 mm打孔器在含药培养基上打孔，再切取相同直径的待测菌株菌饼反贴于含药平板中央，每个处理3次重复。20 ℃黑暗培养7 d(对照菌落直径大于50 mm)，第8天用十字交叉法量取菌落直径。根据含药平板菌落直径与空白对照菌落直径的比值测定供试菌株的甲霜灵敏感性。甲霜灵敏感性划分标准为：含甲霜灵5、100 μg/mL平板菌落直径<40%对照菌落直径为敏感菌株(S)；含甲霜灵5 μg/mL平板菌落直径≥40%对照菌落直径且100 μg/mL平板菌落直 径<40%对照菌落直径为中抗(MR)；含甲霜灵5、100 μg/mL平板菌落直径≥40%对照菌落直径为高抗菌株(R)。

2 结果与分析

2.1 二甲亚砜对马铃薯晚疫病菌生长的影响

由表2可知，随机选取来自迪庆州香格里拉市、大理州洱源县、丽江市玉龙县、曲靖市马龙区和会泽县的8个菌株进行二甲亚砜敏感性测定，结果表明：CK菌落直径在5.00～5.70 cm，50 μL/L DMSO菌落直径在4.93～5.70 cm， 1 mL/L DMSO菌落直径在4.88～5.67 cm，不同浓度的二甲亚砜对这8个马铃薯晚疫病菌的菌落直径没有显著性差异(P>0.05)，表明溶剂二甲亚砜不会影响晚疫病菌的生长，可以作为溶剂溶解98%甲霜灵原药。

2.2 甲霜灵对马铃薯晚疫病菌生长的影响

由表3可知，选用与二甲亚砜敏感性测定相同的8个菌株进行甲霜灵敏感性测定，结果表明CK菌落直径在5.00～5.70 cm，5 μg/mL甲霜灵菌落直径在4.65～5.22 cm，100 μg/mL甲霜灵菌落直径在0.63～4.25 cm；不同浓度的甲霜灵对这8个马铃薯晚疫病菌的菌落直径有显著性差异(P<0.05)，说明甲霜灵会影响晚疫病菌的生长，甲霜灵敏感性测定试验具有可行性。

2.3 云南省马铃薯春作区晚疫病菌对甲霜灵敏感性的测定

对2018-2020年云南省马铃薯春作区采集的301株晚疫病菌进行甲霜灵敏感性测定，结果表明：敏感性菌株所占比例较小，抗性菌株(高抗菌株和中抗菌株)占绝对优势。其中高抗菌株为230株，占总数的76.41%，中抗菌株为64株，占21.26%，敏感性菌株为7株，占2.33%(表4)。除2020年丽江市宁蒗县检测到7株敏感性菌株外，其余采集地点抗性菌株均已达100%，表明甲霜灵在这些区域已失效不能继续使用。

表4 2018-2020年云南省马铃薯春作区晚疫病菌甲霜灵敏感性Table 4 Sensitivity of metalaxyl to Phytophthora infestans in potato of spring cropping area of Yunnan province from 2018 to 2020

3 讨论与结论

甲霜灵对马铃薯晚疫病有很好的防治效果，主要影响卵菌菌丝的生长以及吸器、孢子囊的形成[13]，在生产上一直被广泛应用，但甲霜灵作用位点单一，长期使用该药剂极易使晚疫病菌发生突变，产生抗药性。近年来，全球马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗药性日益严重[14]。赵志坚等[15]研究表明，2000-2003年云南省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵高抗、中抗和敏感菌株所占比例分别为13.2%、9.4%和77.4%。2003-2005年云南省马铃薯晚疫病菌甲霜灵抗性菌株比例为 20.4%[16]。2015-2016年对云南省昆明市马铃薯主产区甲霜灵敏感性测定表明，高抗菌株占100%，未检测到中抗和敏感性菌株[11]。上述研究均表明，甲霜灵抗性菌株在云南省已普遍存在，随着甲霜灵在马铃薯晚疫病菌防治中的长期大量使用，抗性菌株逐年上升，致使甲霜灵防控效果显著下降。

本研究结果显示，2018-2020年云南省马铃薯春作区采集的301株菌株中76.41%表现高抗，21.26%表现中抗，2.33%表现敏感。所有采集地区均出现抗性菌株，这可能与当地甲霜灵施用情况密切相关，长期大量施用单一杀菌剂，导致病原菌产生选择压力，加快抗药性群体的发展[15]；除在丽江市宁蒗县检测到7株甲霜灵敏感性菌株外，其余地区均未发现敏感性菌株，这可能是因为本试验样本容量有限，今后应扩大样本容量，使实验结果更接近实际情况。本研究只对云南省马铃薯春作区甲霜灵敏感性进行测定，冬作区甲霜灵敏感性情况待进一步研究。

虽然甲霜灵敏感性测定是马铃薯晚疫病菌群体遗传多样性研究的重要组成部分，但从目前研究结果来看，甲霜灵抗药性菌株在全国各地区已普遍存在，今后研究中除测定晚疫病菌对甲霜灵的敏感性外，还应对其他常用杀菌剂的敏感性进行测定，这样才对实际生产更有指导意义。

2018-2020年云南省马铃薯春作区晚疫病菌对甲霜灵敏感性已达97.67%，继续使用甲霜灵防治马铃薯晚疫病其效果将下降，筛选和使用新型高效杀菌剂势在必行。