甜荞 FeTCP1基因克隆及胁迫诱导表达分析

朱旭东，熊泽浩，徐 锐，曹 艳，侯泽豪，方正武

(长江大学 农学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北荆州 434025)

TCP是调控植物发育的特异性因子，具有一个非典型的约59个氨基酸的bHLH保守结构域[1]。目前，已知TCP家族的成员可分为PCF亚家族和CIN和CYC/TB1亚家族[2]。PCF亚家族大部分成员的蛋白序列较短，基序组成较为保守，调控基因正向表达；CIN和CYC/TB1亚家族的成员存在一个富含精氨酸的基序(18～20个氨基酸)称为R结构域，主要包含调控植物侧生器官生长和形态发育的基因[3-4]。PCF亚家族成员主要介导细胞生长和分裂的显著刺激，CIN和CYC/TB1亚家族成员则协同抑制细胞生长和分裂[5]。

TCP家族广泛参与调控植物生长、发育、非生物胁迫以及激素反应等，与植物器官形态性状的进化密切相关，控制着花的对称性及叶的性状表型[6]，还参与植株内激素信号的转导[7]。在番茄(Solanumlycopersicum)[8-10]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[5,11-13]、玉米(Zeamays)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]等植物中证实TCP基因在植物逆境应答方面发挥着作用。在拟南芥中AtTCP11通过上调VND7基因的表达量，来引起维管束发育的缺陷；AtTCP3、AtTCP15也是通过调控生长素来响应相关的表达[12]；AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17主要通过依赖和不依赖PITS两个途径来促进生长素的合成[4]。水稻的OsPCF2、OsPCF5、OsPCF6均涉及干旱和冷胁迫的耐受性[15]。

甜荞(FagopyrumesculentumMoench)是蓼科荞麦属植物，具有较强的抗逆能力。目前关于TCP家族成员在甜荞中的研究相对较少。本研究以抗旱品种‘西农9976’为试验验材料，利用同源克隆方法得到FeTCP1基因的CDS序列，运用生物信息学方法对FeTCP1基因序列和编码蛋白序列进行分析和鉴定，利用系统进化树分析不同物种间TCP1蛋白的亲缘关系。同时在逆境胁迫下对FeTCP1基因在甜荞幼苗的转录表达进行实时荧光定量分析。结合蛋白序列和实时荧光定量分析来预测TCP1基因在甜荞中的表达模式。为TCP1基因在逆境胁迫下的功能分析提供理论基础，将有助于进一步研究TCP基因家族的进化关系和分子基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料为甜荞品种‘西农9976’。筛选均一饱满的荞麦种子，经0.1% HgCl 消毒5 min 后，用无菌水洗净，置于培养皿中，25 ℃催芽。待根长生长到2 cm 左右时，将发芽一致的甜荞种子移栽至水培盒，置于人工气候箱中培养，培养条件为：25 ℃ 12 h光照，20 ℃ 12 h黑暗；相对湿度恒定为60%。待培养7 d至甜荞幼苗子叶完全展开时，分别利用15% PEG 6000和0.1% NaCl溶液对甜荞幼苗进行胁迫处理，以处理0 h为对照，设3个生物学重复。分别于胁迫后3 h、6 h、 12 h、24 h和48 h对甜荞幼苗的子叶和根部进行样品采集，液氮速冻后，置于-80 ℃保存，备用。

1.2 FeTCP1基因的克隆

利用RNA试剂盒(RN38)提甜荞幼苗叶片和根部的总RNA，利用反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，根据长江大学耐渍麦类种质资源实验室前期转录组学测序得到的cDNA序列，利用NCBI进行Primer Blast设计特异性引物，PCR扩增出FeTCP1序列。具体引物信息见表1。引物合成和DNA测序均由北京擎科生物公司完成。

表1 引物名称与序列Table 1 Primer name and sequence

1.3 FeTCP1基因生物信息学分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定FeTCP1基因开放式阅读框(ORF)和氨基酸数目；利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)预测FeTCP1的氨基酸长度、分子质量(MW)；利用软件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)预测FeTCP1蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白质三级结构；利用NCBI进行Protein Blast搜索同源序列，筛选双子叶植物中的同源序列，用MEGA 7.0构建系统进化树，确定FeTCP1在各物种间的演化关系。

1.4 FeTCP1基因在干旱和盐胁迫下的表达 分析

在甜荞幼苗胁迫处理后分别提取其叶片和根部的总RNA，去除残留的DNA后检测其质量与完整性，利用cDNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，检测FeTCP1基因在胁迫诱导下的表达模式。使用Primer进行特异性引物设计，上、下游特异性引物分别为QFeTCP-RTF和 Q FeTCP-RTR(表 1)；qRT-PCR检测所用的阳性对照内参基因为甜荞的ACTIN基因(Genbank登录:HQ398855.1)，检测特异性引物分别为QFeACTIN-F 和QFeACTIN-R(表1)。采用两步法PCR扩增程序，使用2-ΔΔCt法计算表达量，用SPSS 19.0 对数据进行显著性分析，用Microsoft excel 2003作图。

2 结果与分析

2.1 甜荞 FeTCP1基因的克隆

利用引物FeTCP1-F/FeTCP1-R对甜荞品种‘西农9976’的cDNA进行扩增，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检验，获得1条1 800 bp左右的PCR产物(图 1)。将目的条带回收纯化后，经连接、转化，筛选阳性克隆进行测序。利用NCBI在线分析序列，开放式阅读框(ORF)为1 623 bp，编码540个氨基酸。进行Blast同源性搜索，结果与茶树CsTCP1(XM_028267645.1)的同源性高达98%，将其命名为FeTCP1，GenBank登录:MW092108。

2.2 FeTCP1基因编码蛋白的生物信息学分析

2.2.1FeTCP1基因编码蛋白的理化性质预测 利用ExPASy预测 FeTCP1蛋白的理化性质。结果表明， FeTCP1蛋白的分子式为C2563H4256N716O797S24，分子质量为58 623.75 ku，等电点为5.97，属于弱酸性蛋白。疏水性总平均为-0.032，不稳定系数为32.67，属于亲水性稳定蛋白。在第96个氨基酸处疏水性最强，峰值达到2.756；在第264个氨基酸处的亲水性最强，峰值达到-2.289。

2.2.2FeTCP1基因编码蛋白的亚细胞定位及保守结构域 利用WOLF PSORT进行亚细胞定位，结果FeTCP1蛋白定位于细胞质中，没有分泌通道信号肽。利用NCBI/CD Search分析FeTCP1蛋白保守结构域。其含有一个TCP1_alpha的保守结构域，属于TCP-1家族、α亚单位。

2.2.3 FeTCP1蛋白的氨基酸序列比对及进化分析 利用DNAMAN 将FeTCP1蛋白的氨基酸序列与芝麻(SiTCP1)、木薯(MeTCP1)、橡胶树(HbTCP1)和猕猴桃(AcTCP1)的TCP1氨基酸序列进行多重比对分析(图 2)。结果表明，5个双子叶植物间的蛋白氨基酸长度基本一致，同源性达96.04%，表明TCP1在这几个物种中存在较高的保守性。

将FeTCP1蛋白序列在NCBI数据库中进行Protein Blast搜索，筛选40个双子叶植物蛋白序列，用MEGA7.0构建系统进化树(图3)。显示甜荞的FeTCP1与甜菜(XM_010683900.2)、睡莲(XM_031646224.1)和罂粟(XM_026525527.1)亲缘关系最近，其中甜菜同为藜科植物。而另一种蓼科植物乌草(XM_021424703.1)与 FeTCP1的亲缘关系则相对较远。与FeTCP1亲缘关系相对最远的是苦瓜(XM_022288799.1)。这些亲缘关系符合植物形态学分类及进化规律。TCP1基因在甜荞与甜菜中的较高同源性，推测FeTCP1基因在双子叶藜科植物中存在着较高的保守性。

2.2.4 FeTCP1蛋白的二级、三级结构预测 利用NPS@预测FeTCP1蛋白的二级结构。预测显示FeTCP1蛋白由51.85%的α螺旋、 15.93%的延伸链、5.37%的β-转角和26.85%无规则卷曲结构组成。利用SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构(图4)，显示FeTCP1与模板6nr8.1.O的三级结构序列同一性达66.35%，与二级结构预测结果基本一致。

2.3 FeTCP1在干旱与盐胁迫下的表达分析

初步分析FeTCP1在甜荞组织中的功能，利用qRT-PCR定量分析甜荞幼苗叶片和根部在干旱和盐胁迫诱导下的表达情况(图5)。结果显示在干旱处理下，FeTCP1在叶片中的表达量均高于对照，在干旱处理12 h左右达到峰值，其大致趋势为先增后减；根的FeTCP1表达量均高于对照、叶片，在6 h达到峰值；在盐处理下，发现FeTCP1的表达情况较为复杂，组织之间存在差异，叶片中FeTCP1的表达量呈上升趋势，12 h后显著高于根的表达量。在根中则呈现下降趋势，在3 h左右达到峰值，之后逐渐下降。

3 讨 论

TCP基因在植物中广泛存在，已在拟南芥[5,11-13]、水稻[15]、玉米[14]、番茄[8-10]等植物中发现TCP参与植物胁迫后的应答反应[16]。水稻OsPCF2蛋白可通过与NHX1基因的启动子结合激活其表达而提高盐耐受性[17]，OsTCP19的过表达可通过上调IAA3、ABI3、ABI4和下调LOX2诱导一些信号通路从而提高拟南芥对干旱与高盐胁迫的耐受性[18]。大多数TCP基因的上游区域至少包含一种激素相关元件，启动子中包含一个或多个与胁迫相关的元件，但激活的时间存在差异[19]。TCP在转录水平和转录后水平上的调节对于植物响应多变的环境条件的发育可塑性至关重要[20]。研究发现大多数TCP基因在干旱胁迫中转录表达量均出现下调，仅且存在少量上调基因。这些研究证实TCP成员参与了干旱胁迫的反应过程，同时，推测出TCP成员在植物器官形态建成[21-24]、逆境应答中的功能特性[19]。

本研究从甜荞中克隆出的FeTCP1共编码540个氨基酸，从功能结构域分析表明，FeTCP1基因具有TCP1_alpha典型结构域属于TCP-1家族-α亚单位。这些蛋白通常是由两个堆叠环组成的双圆环结构，介导多种细胞间隔中ATP依赖的多肽链折叠。通过选取不同双子叶植物的同源序列构建系统发生进化树，结果表明，FeTCP1与甜菜、睡莲和罂粟亲缘关系最近，与苦瓜的亲缘关系相对最远，表明TCP1基因在双子叶藜科植物中存在着较高的同源保守性。本研究中FeTCP1基因在PEG与盐诱导胁迫过程中叶片和根部中的表达量均出现上调，证实FeTCP1参与干旱胁迫调控，与前人研究相似[7,9]。但本研究中FeTCP1基因属于TCP家族中少数上调基因，且FeTCP1的表达量在48 h的胁迫处理下先增后减。与其他研究不尽相同，这种差异可能由于物种间差异以及植物的生长发育阶段的变化所导致。

甜荞FeTCP1可以响应15% PEG 6000和0.1% NaCl盐胁迫，证实FeTCP1基因参与干旱胁迫的应答调控。干旱响应机制主要包括光合作用、渗透调节、抗氧化系统以及各种蛋白质和代谢物合成等，主要涉及渗透稳态、胁迫伤害控制和生长控制3个方面。下一步的研究方向为通过转基因技术探究FeTCP1主要参与干旱响应的哪些过程以及具体的调控机理机制，为培育优良的抗逆品种提供借鉴。