光照处理对冬虫夏草单孢菌株生长代谢的影响

谢 放，苏强军，夏樱霞，李佳莹，陈照禾，周 刚

(兰州交通大学 生物与制药工程学院,兰州 730070)

光照是生物体重要的能源和信息源。对真菌而言，光照主要作为信息源而非能源。多年来在真菌的研究中，有上百种的真菌都发现了光反应机制的存在[1]。光的作用机制是复杂的，对不同真菌而言，不同的光质与波长对其影响作用不同，既可以促进真菌的发育，也可抑制真菌的发育[2]。

在高等丝状真菌以及虫草属真菌的报道中，已经证明感光基因在真菌中的存在，并与其生长代谢有密切关系[3-4]。在对蛹虫草的研究中发现，蓝光照射下蛹虫草原基分化更快更多，对蛹虫草子实体产量没有明显的促进和抑制作用[5]。敲除Cmwc-1基因的蛹虫草均不能形成原基和子实体，光照后不转色，分生孢子、类胡萝卜素和虫草素产量较野生型低，表明光受体Cmwc-1调控蛹虫草的生长发育和代谢产物的产生[6-7]。适当的蓝光光照有助于柞蚕蛹虫草子座的生长，光照度为308.37lx，光照时长为10.6h/d时，最利于胡萝卜素的合成，光照度和光照时间的变化对蛹虫草子座的生长均有一定的影响[8]。

冬虫夏草是由冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫而形成的虫草复合体，仅分布于青藏高原及周边高海拔地区。其可分为有性阶段和无性阶段两种形态，学术界普遍认为冬虫夏草的无性型为中国被毛孢(Ophiocordycepssinensis)[9]，这一结论普遍得到了分子生物学证据的支持[10]。冬虫夏草菌归属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)线形虫草属(Ophiocordyceps)[11]。近年来，由于野生有性型被无限制地采挖，致使野生有性型数量锐减[12]。因此，通过培育冬虫夏草无性型获得菌丝体作为天然冬虫夏草的替代品显得尤为重要。对于温度、pH、碳氮源、无机盐等条件对中国被毛孢生长发育的影响较为清楚，文献报道相对较多，但对于光照与中国被毛孢生长发育之间的关系鲜有报道。目前只知道在中国被毛孢有性阶段子囊孢子的弹射需要一定的紫外照射[13]，而对于无性阶段，光照对其有何影响，并无相关研究。

多年来冬虫夏草的研究结果在不同的报道中出现相互矛盾的现象，这种现象的出现极有可能与研究中所使用的真菌材料存在较大的差异有关[14]。一直以来对于冬虫夏草是否为多菌种复合体有很大争议[15]，对其宏基因组研究发现，不同样品中真菌和细菌组成分布是有所不同的[16]。这使得选择高纯度的菌种材料成为研究冬虫夏草的重要一环。

以往的研究材料基本上采用组织分离所得到的菌株，鉴于冬虫夏草的无性型为中国被毛孢仍有一些不同看法，为严谨起见，本研究采用冬虫夏草子囊孢子分离得到的单子囊孢子菌株作为研究材料。在经过光照处理后观察、检测其菌落形态、菌丝形态、鲜质量、干质量、分生孢子量、甘露醇、多糖、尿素、多酚及腺苷的含量与黑暗条件进行对比，初步了解光照处理对中国被毛孢的影响，旨在探明光照因素对中国被毛孢菌丝体生长代谢的影响规律。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 子囊孢子于2019年采自甘肃省武威市天祝县代乾牧场的冬虫夏草，获得的单子囊孢子菌株命名为TZ8-1(现保存于兰州交通大学化学与生物工程学院生物种苗研究所)。

1.1.2 培养基 (1)牛奶培养基：每1 L培养基中包含土豆200 g，牛奶200 mL，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水解乳蛋白5 g，酵母粉1 g，硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾1 g，复合维生素B 1片，蒸馏水 1 000 mL。

(2)水琼脂培养基：每1 L培养基含琼脂10 g，蒸馏水1 000 mL。

(3)1/2 PPDA培养基：每1 L培养基含土豆100 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，琼脂7.5 g，链霉素0.1 g，四环素0.05 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 试验仪器 光照培养箱(LRH-250-G)，低温培养箱(LRH-200CL)，紫外-可见光分光光度计(U759),超高效液相色谱仪(Waters Acquity UPLC I-Class，沃特世，美国),精度电子天平(JJ500),高压蒸汽灭菌锅(BXM-30R),恒温数码显示水浴锅(HH-2),超声波清洗器(KQ-250DE)。

1.1.4 试剂 甲醇(色谱纯)、腺苷标准品(中国药品生物制品鉴定所)及其他药品(无特殊说明均为分析纯)。

1.2 方 法

1.2.1 单孢菌株的分离 首先用无菌的玻璃纸套收集冬虫夏草子囊孢子，将收集的子囊孢子用无菌水冲洗脱落，置于18 ℃的恒温培养箱内萌发5 d，待子囊孢子萌发后取200 μL均匀的浸涂在事先准备好的水琼脂培养基内，待培养基表面无液体时，将水琼脂平板移至于光学显微镜下找到单个已经萌发的子囊孢子将其挑出，接种于提前准备好的1/2 PPDA培养基中，再将接种有单子囊孢子的1/2 PPDA平板放置于18 ℃的恒温培养箱内，待其生长60 d后便可得到由单个冬虫夏草子囊孢子发育而来的菌株[17]。

1.2.2 单孢菌株的验证 由于中国被毛孢菌丝体致密，用普通的真菌基因组DNA抽提试剂盒难以提取到基因组DNA，故选用动物基因组DNA抽提试剂盒提取单孢菌株的基因组DNA，PCR扩增ITS序列并由华大基因测序，用MEGA-X软件构建NG系统发育树。

1.2.3 光照处理 将中国被毛孢单孢菌株转接至牛奶培养基中，置于18 ℃的恒温培养箱内，包裹4层报纸和1层锡箔纸来隔绝散射光，黑暗培养30 d后，取出一半置于18 ℃恒温光照培养箱内，光照度约为300 lx，光质为LED全光谱的植物生长调节光，培养30 d。另一半继续置于黑暗条件下18 ℃恒温培养30 d。

1.2.4 菌落与菌丝形态的观察 观察光照与黑暗条件下中国被毛孢菌落形态、大小、颜色、色素沉积程度。用透明胶带轻粘菌丝，再将粘有菌丝的透明胶带固定至载玻片上，放置到光学显微镜下400倍观察并记录光照与黑暗条件下中国被毛孢菌丝形态有何差异。将同一显微镜视野以九宫格分开，选取四角与最中心的5个格，挑取每格中最清晰完整的两根菌丝，测量菌丝两拐点间的长度，记录并求平均值，每组试验设3个平行。

1.2.5 分生孢子数量的统计 加入5 mL无菌水于菌落平板内，用毛笔轻轻刷洗菌落表面，将分生孢子从菌落表面洗下，再用无菌水润洗过的4层纱布将菌丝、培养基等杂质过滤掉，最后定容到10 mL。将得到的分生孢子液每次取10 μL于光学显微镜下计数，重复10次，计算得到100 μL分生孢子液的浓度，进一步计算得到10 mL分生孢子液中分生孢子的数量，每组试验设3个平行。

1.2.6 菌落鲜质量与干质量的测量 将整个菌落连带培养基一起取下，用热水洗去培养基得到干净完整的菌落，再用吹风机吹干菌落表面水分，之后用电子天平秤量菌落鲜质量。再将菌落置于55 ℃干燥烘箱中，期间每20 min秤量一次，直至质量不再变化为止，以最后一次秤量结果记为菌落干质量，每组试验设3个平行。

1.2.7 甘露醇、多糖、尿素和多酚含量的测定 甘露醇含量的测定采用高碘酸钠比色法[18]，多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[19]，尿素含量的测定采用PDAB法[20]，多酚含量的测定采用Folin-酚法[21-22]，每组试验设3个平行。回归方程如表1所示，4个回归方程均是将标准品配置成6个浓度梯度所测得，相关系数均大于0.99，这说明试验所得标准曲线线性关系良好，均能为下一步试验所用。

表1 4种代谢物的回归方程Table 1 Regression equations of four metabolites

1.2.8 用超高效液相色谱法测量腺苷的含量 样品的前处理：秤取菌丝体粉末0.05 g加入2 mL超纯水,超声波100 W、60 ℃处理90 min, 12 000 r/min离心10 min，取上清,重复提取3次，上清合并过0.22 μm滤膜后进行超高效液相色谱检测[23]。

对照溶液的配置：精密秤取腺苷对照品1.26 mg，用超纯水溶解稀释并定容至5 mL容量瓶中，制成腺苷质量浓度为252 mg/L的对照品储备液，再用超纯水分别稀释2、4、8、16、32倍得到腺苷质量浓度分别为126、63、31.5、15.75、7.875 mg/L的标准工作溶液，置于4 ℃冰箱冷藏，备用[24-25]。

色谱条件：色谱柱为 Waters ACQUITY YPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流速为0.25 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，流动相为0.3%甲酸水溶液与甲醇,梯度洗脱程序见表2[26]。

表2 UPLC梯度洗脱程序Table 2 UPLC gradient elution procedure

标准曲线与回归方程：如图1所示，以腺苷峰面积(yi)与对应的腺苷质量浓度(xi,mg/L)作曲线，经计算其回归方程为y=58 421x+ 1 919 970(R2=0.996)，表明腺苷标准品质量浓度在7.875～252 mg/L范围内线性关系良好。

1.2.9 数据分析 采用SPSS 20.0进行显著性分析，采用Origin 2018绘制图像。

2 结果与分析

2.1 单孢菌株的分离及验证结果

由图2-c～h可以看出，单子囊孢子在 1/2 PPDA培养基上呈放射状生长，待其长至48 d左右时便能形成肉眼可见的菌落。通过冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株，是由单个子囊孢子发育而来的单系菌株，排除了组织分离菌株多菌杂合的可能，故其可靠性高于组织分离所得到的菌株，并通过ITS鉴定，确认所得单孢菌株为中国被毛孢(图2-e)。以该菌株作为试验材料可靠性更高，更具有说服力。同时，ITS鉴定结果也进一步佐证了冬虫夏草的无性型是中国被毛孢。

2.2 光照处理对中国被毛孢菌落形态和菌丝生长的影响

2.2.1 光照处理对中国被毛孢菌落的影响 由图3-a和图3-c可以看出，光照处理对中国被毛孢菌落形态有显著影响。在外形上光照处理后中国被毛孢菌落形态呈蚯蚓粪状，菌落表面布有绒毛状气生菌丝，菌落外周布有明显致密的黄色环状菌丝带，菌落直径大小无显著变化(表3)。在其他丝状真菌的研究中已经证明光照会对菌丝的生长有一定的抑制作用，且这种抑制作用是普遍存在的[27-28]。这与本试验结果有所差异，究其原因可能与中国被毛孢菌丝生长特性有关。中国被毛孢生长缓慢，菌丝形态多是以基生菌丝为主，其形态结构与气生菌丝有极大的区别，而光照对菌丝生长的抑制多数指的是对气生菌丝的影响。另外，光照强度与光质对菌丝生长的影响极大，本试验采用的光照条件或许并未达到抑制中国被毛孢菌丝生长的条件也是极有可能的。

在色素沉积方面也有显著影响。光照处理后菌落外周菌丝出现了明显的黄褐色，菌落内侧变化不明显，培养基内色素沉积也显著加深(图3-b、3-d)。这种颜色上的差异说明光照处理可以促进中国被毛孢色素的形成，而这种促进作用极有可能与光保护机制的形成有关。在真菌色素的研究报道中相对较多的是类胡萝卜素，对其合成代谢过程已有详细报道[29]，其中光照对其合成有明显的促进作用。尤其对于蛹虫草而言，光照是其类胡萝卜素产生的必要条件，且类胡萝卜素的沉积有助于蛹虫草光保护机制的形成[30]。对于本研究中所提到的色素是否也为类胡萝卜素，有待进一步研究。

光照处理后菌落鲜质量极显著低于黑暗处理组，而干质量却无明显变化(表3)。从这种变化可以看出光照处理对中国被毛孢总的生物量并没有明显的改变，但鲜质量明显低于黑暗处理组，这极有可能与菌落中自由水含量有关。在试验过程中发现，光照处理组菌落平板表面有明显的水珠凝结，但黑暗处理组并没有发现该现象。由此可以推断，光照处理可以加剧菌落平板中自由水的蒸发，从而使得光照处理组菌丝体的自由水含量低于黑暗处理组，进而影响鲜质量，但由于总的生物量没有改变，所以菌落干质量并没有明显差异。

2.2.2 光照处理对中国被毛孢气生菌丝的影响 由图4-a和图4-b可以看出，光照处理对中国被毛孢气生菌丝生长有显著影响，黑暗处理组的中国被毛孢气生菌丝无明显的扭结现象，而光照处理组的气生菌丝出现扭结现象。有研究发现光照可以诱导绣球菌的原基形成，在对照组黑暗处理下原基无法形成[31]。光照处理后菌丝扭结的出现，说明光照能够促进中国被毛孢气生菌丝形成扭结，而这种扭结的增多是否会影响后续原基的形成，这有待进一步验证。

光照处理对于气生菌丝的直线延伸有极显著的影响，黑暗处理组气生菌丝拐点间的平均长度约为42 μm，而光照处理组气生菌丝拐点间的平均长度约为32 μm(表4)。由此可以看出，光照处理对气生菌丝的延伸有抑制作用，这种抑制主要表现在气生菌丝更易出现弯曲，延伸程度不及黑暗处理组。在植物生长发育过程中，光照会促使植物合成光敏色素，这种物质会直接影响植物茎的伸长以及向光的敏感性[32]。真菌在受到光照处理后，也有可能会促使真菌产生类似的物质，进而影响真菌菌丝的延伸。

光照处理对分生孢子数量的影响也极为显著，黑暗处理组分生孢子量约为0.625×109个，光照处理组分生孢子量约为0.433×1010个，光照处理组约有黑暗处理组的7倍之多(表4)。可见光对于分生孢子的形成有重要意义，光照往往可以诱发有性和无形结构的形成。对于光在真菌中触发产孢机制的形成，目前已有清楚的认知。当近紫外光照射到菌丝上时，菌丝中会产生一种被称作P310的物质，这种物质可以促进分生孢子的产生[33]。由此可以推测出光照处理后中国被毛孢极有可能也会产生这种类似于P310的物质，从而使得分生孢子数量明显高于黑暗处理组。在其他丝状真菌的研究中也有光照能够促进分生孢子形成的大量报道[34-35]。这与本试验结果类似，说明光照促进高等真菌分生孢子的形成是一种普遍现象，而非某个物种所特有。

2.3 不同条件下中国被毛孢活性物质含量

由图5可以看出，光照处理组与黑暗处理组相比，多糖与尿素含量差异极显著，甘露醇与多酚含量差异不显著。其中，甘露醇的含量在光照处理组的测定值为54.841±1.637 mg/g，黑暗处理组的测定值为50.254±1.213 mg/g。多糖含量在光照处理组的测定值为98.701±10.569 mg/g，黑暗处理组的测定值为172.552±4.633 mg/g。尿素含量在光照处理组的测定值为 5.304±1.852 mg/g，黑暗处理组的测定值为 26.787±1.176 mg/g。多酚含量在光照处理组的测定值为4.175±0.639 mg/g，黑暗处理组的测定值为6.386±0.525 mg/g。

由代谢物含量的变化可以看出，光照处理对中国被毛孢代谢活动有显著的影响。多糖是生物体中最常见的初级代谢产物，作为生物体的主要碳源，用以合成其他含碳物质。光照处理后中国被毛孢多糖含量显著降低，极有可能是光照后促使中国被毛孢合成有关光保护机制的物质(如色素含量的增加)，而大量消耗原有的多糖，促使光照组多糖含量显著低于黑暗组。尿素由于其自身结构使其对调节细胞内渗透压有着重要作用[36]。由“2.2.1”中提到的菌丝体自由水含量减少可知，细胞渗透压会随着自由水的减少而升高，为了维持细胞渗透压的平衡，可能会使细胞内尿素含量有所降低，这可能与光照处理组尿素含量不及黑暗处理组有一定的关联。而在其他真菌的相关研究中也有报道称光照对真菌代谢有一定的抑制作用[37]，但对这种抑制作用并没有足够的解释。

2.4 不同处理下腺苷的含量

通过UPLC测定腺苷标准品溶液得到图6-A所示的腺苷标准品峰图，出峰时间约为 2.2 min左右，由此可以推断出图6样品组B图和C图所示的2.2 min对应的峰应为腺苷。通过积分函数求得样品组腺苷峰图面积，再将面积带入回归方程，最终得到黑暗处理组腺苷含量约为40.698±3.726 mg/L，光照处理组腺苷含量约为59.463±5.425 mg/L。

由上述不同处理组腺苷含量可以看出二者差异显著。腺苷是冬虫夏草中主要的活性物质，其含量与药用价值有着直接的联系。由上述结果可以得出，光照处理会对中国被毛孢菌丝体中的腺苷含量产生显著的促进作用。这说明给予中国被毛孢一定的光照会促进其合成腺苷，进而影响其药用价值，所以光照可以作为中国被毛孢合理的生长条件加以应用。有关蛹虫草的研究报道称，蓝光处理会对蛹虫草菌丝体中腺苷类物质含量有一定的抑制作用[37]，这与本试验结论不符。究其原因可能与其所用的蓝色单色光有一定联系，也有可能是冬虫夏草与蛹虫草间存在一定的物种 差异。

3 讨 论

关于光照处理后菌落鲜质量下降的问题，需要探讨的是这种现象产生的机制。本试验所使用的是LED的冷色光源，并在18 ℃的恒温条件下进行的试验，所以光照并不会对培养环境的温度产生明显影响。对于水分的蒸发需要提升分子间的自由能才能提升其蒸发速率，在环境温度不变的情况下是什么让水分子间自由能改变，增加了其蒸发速率，这着实让人费解。笔者猜测，虽然有培养箱控温系统的存在，使得环境温度并不会有明显的变化。但是由于光照后平板内的培养基会吸收一部分光能，而这部分光能会以热能的形式进而促使培养基中自由水的蒸发，从而造成菌丝鲜质量的差异，这需要更加精细的试验设计来 确认。

关于光照处理后菌丝出现明显的扭结现象，这种扭结是否会对将来原基的出现有一定影响，值得探讨。笔者认为，这种扭结与后期原基的形成乃至子实体的形成关系并不大。一般在自然状态下，冬虫夏草在子实体发育启动之前一直处于地底的黑暗条件下，是在无光的条件下启动子实体发育的。故而，光照后出现的菌丝扭结与原基出现并无直接联系。

在对真菌的研究中发现，不同真菌对不同波长光质的反应不同，不同生长发育阶段对光强、光质的要求均有差异[38]。由于光照处理对中国被毛孢生长代谢影响的研究鲜有报道，因此，本试验优先选择光质为全光谱的植物生长调节光，根据其他真菌的最适光照条件将光照度定在300 lx左右，并没有验证不同光质、不同光强对中国被毛孢的影响。因此，本研究所得到的光照对中国被毛孢生长代谢影响的结果都有可能会随着光照条件的改变而发生变化，这些需要今后进一步深入研究。另外，对于本试验发现的光照处理后所产生的色素，也需后续进一步研究其类别和性质。

4 结 论

光照处理对中国被毛孢菌落形态产生显著影响，色素沉着明显加深，菌落鲜质量显著低于黑暗处理组，但总的生物量并没有明显改变；光照处理对中国被毛孢菌丝的直线延伸产生显著的抑制作用，菌丝出现明显的扭结现象，并且极显著促进分生孢子的产生，数量是黑暗处理组的7倍之多；光照处理后中国被毛孢多糖和尿素含量显著低于黑暗处理组，甘露醇与多酚含量无明显变化；光照处理后中国被毛孢腺苷含量显著高于黑暗处理组。