金纳米复合丝素膜的制备及其表面增强拉曼散射效应的研究

华 威，孙莎莎 ，许 浩，林生岭

(江苏科技大学 环境与化学工程学院，镇江 212100)

表面增强拉曼散射是指待测物分子吸附于粗糙贵金属表面，在入射激光的照射下，其拉曼散射信号获得显著增强的光学现象[1].SERS光谱不仅提供分子的振动指纹信息，而且具有稳定性好、水干扰小、可猝灭荧光、分辨率高、探测灵敏度高等优点，因此广泛应用于环境污染物、食品安全、生物医药等有害分子的检测[2-8].贵金属纳米粒子(Au、Ag)作为拉曼增强最常用的纳米粒子，在光场照射下能够激发局域表面等离子体共振，但银纳米颗粒具有较强的生物毒性，在空气中极易氧化等限制了其在生物医学领域的发展[9].相比之下，金纳米颗粒尽管拉曼增强效果略弱，但生物相容性好、合成步骤简单等特点使其在光热治疗、生物分子检测、成像等领域得到了广泛应用[10-12].由于贵金属纳米粒子易于发生聚集现象使得稳定性和重复性较差，因此制备一种具有优良增强活性、良好稳定性、生物相容性好的新型活性基底成为SERS研究的热点之一.丝素蛋白具有良好的可加工性、可降解性、机械稳定性和生物相容性被广泛应用于组织修复、植入式生物传感器[13-15].由于丝纤维上的酪氨酸基团可以将金离子还原成金纳米颗粒，科研工作者利用原位合成方法将丝素蛋白作为稳定剂和还原剂在丝素纤维表面生成金纳米颗粒用于SERS痕量分析[16-17].文中主要采用原位合成和物理混合两种方法制备金纳米复合丝素膜(AuNPs-SF)，通过比较金纳米复合丝素膜形貌和结构等，探讨不同合成方法的SERS效应.

1 实验

1.1 仪器及试剂

药品均为商品化分析纯试剂，蚕茧由江苏科技大学蚕业研究所提供，去离子水实验室自行制备.

结构和形貌在X射线衍射仪(XRD)(理学公司，日本)，场发射扫描电子显微镜(ZEISS，德国，蔡司公司)和紫外-可见分光度计(UV-2550，日本，岛津公司)上进行，SERS效应在拉曼光谱仪(HR800，日本，掘厂公司)上进行.

1.2 丝素膜的制备

蚕茧剪成小块，0.02 mol/L Na2CO3水溶液煮沸30 min去除丝胶蛋白.然后用去离子水冲洗3～5次，铺平，于60 ℃烘箱中干燥.脱胶后的丝素蛋白置于9.3 mol/L LiBr溶液60 ℃ 4 h溶解.溶解后的丝素蛋白溶液放置于透析袋(截留分子量3500 KDa)透析72 h，每4 h换一次水.透析后的丝素蛋白溶液9 000 r/min离心20 min，除去未溶解的丝素聚集体.将2 mL蚕丝溶液与质量分数为3%甘油混合均匀在60 ℃条件下4～5 h浇铸成丝素膜(SF).

1.3 原位合成制备金纳米复合丝素膜

1.3.1 一步合成法

将丝素膜在1 mmol/L氯金酸(HAuCl4)溶液中85 ℃加热75 min.反应结束后冲洗干燥，得到金纳米丝素复合膜1(AuNPs-SF1).

1.3.2 两步合成法

将丝素膜浸泡在含1% HAuCl4浸渍液的30 mL去离子水溶液中，4 ℃冰箱中反应24 h.24 h后，丝素膜和混合液在75 ℃下反应4 h.反应结束后冲洗干燥，得到金纳米丝素复合膜2(AuNPs-SF2).

1.4 物理混合制备金纳米复合丝素膜

制备30 nm金纳米颗粒：将0.5 mL质量分数为1%的HAuCl4·3H2O溶液加入到50 mL水中，搅拌并加热至沸腾，然后在搅拌下快速加入0.65 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，持续加热煮沸15 min.冷却至室温，得到酒红色金纳米颗粒.将金纳米颗粒与含3% 甘油的丝素蛋白溶液混合均匀后浇膜，得到金纳米丝素复合膜3(AuNPs-SF3).

2 结果与讨论

2.1 丝素膜改性

由于甘油吸湿性强，与蚕丝蛋白结合后使其变得柔软而富有弹性，图1为纯丝素膜和分别添加1%、3%、5%甘油的丝素膜力学性能测试.根据图1发现未添加甘油的丝素膜应力应变曲线属于典型的脆性断裂，而添加3%甘油后大大提高了丝素膜的柔韧性，这说明甘油起到了增塑剂的作用[18-19].同时由于甘油的加入，丝素膜构象由无规线团向β-折叠转变，发现含3% 甘油的丝素膜既保持透明性，又具有较低的含水率.因此适于制备金纳米复合丝素膜.

图1 纯丝素膜和添加甘油丝素膜的应力-应变曲线Fig.1 Stress-strain curves of pure SF and SF containing glycerol

2.2 金纳米复合丝素膜形貌结构分析

图2为丝素膜和金纳米复合丝素膜的扫描电镜图及自然光下的图片.由图2(a)清楚观察到改性后丝素膜为表面光滑的透明薄膜，这与SEM图结果一致.采用原位合成方法成功在丝素膜上合成出金纳米颗粒.由图2(b)观察到在自然光下丝素膜从透明变为黄色，SEM图显示丝素膜表面合成的金纳米颗粒分布不均，还有一些团聚在一起，形成不规则形状.而图2(c)中金纳米颗粒大小一致、分布均匀，平均粒径约为30 nm.插入图显示自然光下整张膜呈酒红色.这说明以丝素蛋白为还原剂，通过还原HAuCl4·xH2O在丝素膜表面成功合成出分散良好的金纳米颗粒.由于物理混合，从图2(d)看到合成好的金纳米颗粒被包裹在丝素膜内部.

图2 丝素膜和金纳米复合丝素膜的SEM图Fig.2 SEM images of SF and AuNPs-SF

图3为丝素膜和AuNPs-SF2的XRD谱图.改性后丝素膜(图3(b))显示出强衍射峰(2θ=20.70°)，弱衍射峰(2θ=24.50°)和两个肩衍射峰(2θ=28.8°和40.00°).

图3 丝素膜和AuNPs-SF2的XRD谱图Fig.3 XRD spectra of the SF and AuNPs-SF2

这些XRD衍射峰归属于丝素蛋白的β-折叠结构，表明添加3%甘油后的丝素膜具有高结晶度.与丝素膜相比，用原位合成方法制备的AuNPs-SF2XRD图谱中出现4个新的XRD峰，分别为2θ=38.40°，44.60°，64.80°和77.80°，这归因于(111)，(200)，(220)和(311)金的面心立方结构[20].这些结果还证明了在丝素膜上成功合成金纳米颗粒.此外，在原位合成金纳米颗粒后，丝素膜的XRD特征峰没有发生明显变化表明在反应过程中丝素膜的晶体结构始终保持不变.

从图4可以看出，与丝素膜相比，制备的金纳米复合丝素膜均有明显的吸收峰.与SEM和XRD结果一致，证明丝素膜表面存在金纳米颗粒.AuNPs-SF2的UV-vis 吸收光谱显示出一个单一的吸收带位于535 nm处，这是球形金纳米颗粒的局域等离子体共振(LSPR)引起的.而AuNPs-SF1肩带的出现表明在丝素膜上原位合成的金纳米颗粒具有各向异性[21].

图4 丝素膜和金纳米复合丝素膜的紫外-可见吸收光谱Fig.4 UV-vis absorption spectra of the SF and AuNPs-SF

2.3 金纳米复合丝素膜SERS效应研究

对样品进行拉曼表征，用4-MBA常作为SERS效应的探测分子，因为其具有明显的拉曼峰.用1 mmol/L的4-MBA浸泡样品12 h，4-MBA中的巯基与金原子形成配位键(金原子提供空轨道，巯基提供孤对电子)，单分子层吸附到金结构表面，之后用乙醇清洗基板表面将多余的4-MBA除去.最后用拉曼光谱仪进行表征.图5为丝素膜和不同方法制备金纳米复合丝素膜的拉曼光谱图.与丝素膜的拉曼光谱图5(a)相比，图5(b)金纳米颗粒容易发生团聚生成不规则形状的大尺寸颗粒活性较低，因此并未检测到明显的拉曼信号.而AuNPs-SF2(图5(c))作为拉曼增强基底时出现明显的峰值，增强了约100倍，说明其具有良好的拉曼增强效果.这是因为金纳米颗粒在丝素膜上紧密排列，相邻的金纳米颗粒之间形成“热点”，强烈的电磁场使得拉曼散射得到增强.如图5(c)所示，1 613 cm-1处的峰值归因于C-C和C-S键的拉伸模式，丝素蛋白的β-折叠结构造成1 724 cm-1处的峰值，CH2的摇摆振动造成875 cm-1处的弱峰，C-H键的弯曲产生1 089 cm-1和1 103 cm-1处的两个弱峰，1 276 cm-1处的弱峰是因为C-O-C的不对称拉伸.图5(d)中由于金纳米颗粒被包裹在丝素膜内部不能与4-MBA形成配位键，而未表现出SERS效应.拉曼光谱结果表明金纳米颗粒的活性不仅与所处位置有关，而且与丝素膜表面金纳米颗粒的形貌有关.

图5 丝素膜和金纳米复合丝素膜的拉曼光谱图Fig.5 Raman Spectra of the SF and AuNPs-SF

3 结论

文中首先采用添加甘油对丝素膜进行改性，促进β-折叠的形成，提高其结晶度.通过物理混合和原位合成的方法将丝素膜与金纳米颗粒结合在一起.物理混合将金纳米颗粒包裹在丝素膜内部，无明显的SERS效应.而采用原位合成法均可在改性后的丝素膜表面合成出金纳米颗粒.用4-MBA作为SERS效应的探测分子，拉曼光谱显示只有两步合成法制备的AuNPs-SF2具有良好的SERS效应.AuNP-SF2表面金纳米颗粒分布均匀，平均粒径约为30 nm，紫外-可见特征吸收峰出现在535 nm处，合成过程中未改变丝素膜的结构.金纳米颗粒和改性后的丝素膜都具有良好的生物相容性，未来在生物检测方向具有巨大的发展潜力.